التحليل الطيفي لتذبذب التألق لدراسة القلة المتجانسة للبروتين

يمكن أن يحدد التحليل الطيفي لتذبذب التألق حالة قلة البروتينات في العينة.

للبدء ، خذ شريحة ذات حجرة تحتوي على محلول مونومر بروتين يحمل علامة الفلورسنت. ضع الشريحة تحت مجهر متحد البؤر. ركز شعاع الليزر على جزء صغير من العينة — الحجم متحد البؤر — لإثارة مونومرات البروتين.

تنتشر جزيئات البروتين داخل وخارج الحجم متحد البؤر بسبب الحركة البراونية. تسبب هذه الحركة تغيرات سريعة في شدة التألق ، مما يؤدي إلى تقلبات في شدة التألق بمرور الوقت.

أضف عامل الثنائي - وهو رابط ثنائي التكافؤ يساعد اثنين من مونومرات البروتين على الارتباط ، وبالتالي تشكيل ثنائي. بسبب الاختتاث ، يجتمع ملصقان فلوريان معا لتشكيل جسيم واحد ، مما يزيد من شدة التألق لكل جسيم - السطوع الجزيئي.

تزيد الزيادة في السطوع الجزيئي بسبب التعتيم من اتساع تقلبات التألق - حيث يدخل ملصقان فلوريان ويخرجان الحجم متحد البؤر معا.

احصل على صور للحجم متحد البؤر عبر الزمن قبل وبعد إضافة عامل الثنائي.

احسب سطوع وحدات البكسل الفردية في الصور متحدة البؤر، واحصل على متوسط منحنى السطوع بمرور الوقت.

إضافة عامل التعتيم إلى زيادة السطوع بمقدار ضعفين بسبب إشارات التألق المزدوجة من كل جسيم ، بينما يظل العدد الإجمالي لجزيئات البروتين كما هو - مما يشير إلى تكوين ثنائيات.

لإعداد مصفوفة الألواح متعددة الآبار ، أولا ، قم بإعداد محلول من 100 نانومولار منقى FKBP12 في نفس المخزن المؤقت المستخدم لكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. صوتيا وأجهزة الطرد المركزي مع دوران سريع يبلغ 13,000 دورة في الدقيقة لمنع تكوين الركام.

الآن ، قم بتقطيع الماصة من 100 إلى 200 ميكرولتر من البروتين المخفف في غرفة مراقبة مكونة من 8 آبار ذات قاع زجاجي. أضف ثنائي الميكروبيد BB إلى التركيزات النهائية 10 و 20 و 40 و 80 و 100 و 150 و 300 و 500 نانو مولار. كمرجع ، قم بإعداد محلول 100 نانومولار mVenus وحده لتقييم تأثيرات التجميع وهطول الأمطار المحتملة ، ولاستعادة قيمة السطوع للمونومر بنفس إعدادات الاستحواذ.

يمكن استخدام أي نظام متحد البؤر لمجهر المسح الضوئي المجهز بكاشفات رقمية أو كاشفات تناظرية مميزة جيدا ، وقادر على الحفاظ على وقت مكوث ثابت لكل بكسل يتم الحصول عليه. حدد هدف الغمر في الماء لتصحيح الياقة المصمم للتحليل الطيفي لارتباط الفلورة.

أضف الآن قطرة ماء إلى هدف الغمر في الماء لتصحيح ذوي الياقات البيضاء. قم بتركيب غرفة المراقبة المكونة من 8 آبار في المسرح. اضبط مسار شعاع الإثارة عن طريق تشغيل الليزر 514 نانومتر ، وضبطه على طاقة 20 إلى 100 نانووات عند الخروج من الهدف. قم بتشغيل كاشف HyD واحد. يفضل استخدام أجهزة الكشف القادرة على عد الفوتونات. حدد نافذة الانبعاث من 520 إلى 560 نانومتر.

بالنسبة لوضع الاكتساب ، استخدم 16 × 16 بكسل.

اضبط وقت سكون البكسل بحيث يكون وقت الإطار أطول من انتشار البروتين ، ويكون وقت سكون البكسل أقصر بكثير. يتوافق هذا مع ضبط وقت السكون على حوالي 13 ميكروثانية للنظام المستخدم في هذا العرض التوضيحي.

اضبط الثقب في وحدة Airy واحدة للانبعاث المقابل البالغ حوالي 545 نانومتر. حدد وضع الاستحواذ xy-time وحدد عدد الإطارات التي سيتم الحصول عليها لكل عملية استحواذ وبئر. الآن ، اضبط حجم البكسل على حوالي 120 نانومتر.

إذا كان النظام مزودا بوضع عالي الإنتاجية ، فأدخل إحداثيات كل بئر ، وعدد عمليات الاستحواذ لكل بئر لأتمتة العملية. إذا كان النظام مزودا بنظام التروية ، فقم بتحميل محلول BB ، وقم ببرمجة التروية لتبدأ مباشرة بعد الإطار 5,000 لتقييم حركية التضليل مع الحصول على 10,000 صورة.

حدد البئر الصحيح ، وركز على الحل. بعد ذلك ، ابدأ عملية الاستحواذ واحفظ مجموعة الصور الناتجة بتنسيق TIFF.