مقايسة سحب بروتين الحمض النووي الريبي لعزل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي عن طريق استخراج التقارب

لعزل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي ، أو RBPs - منظمات ما بعد النسخ - خذ تعليقا من مجسات الحمض النووي الريبي الصغيرة التي تحتوي على عنصر غني بالأدينيلات واليوريديلات ، أو ARE - وهو تسلسل معترف به بواسطة RBPs المستهدفة. يتم تصنيف مجسات الحمض النووي الريبي ب desthiobiotin - مشتق من البيوتين.

أضف حبيبات مغناطيسية مطلية بالستربتافيدين - وهو بروتين له تقارب مع البيوتين. احتضان تحت التحريض لمنع الخرز من الاستقرار. يرتبط الحمض النووي الريبي المسمى بالديستيوبيوتين بالستربتافيدين ، وبالتالي يشل حركة الحمض النووي الريبي على الخرز.

تحت المجال المغناطيسي ، تتجمع الخرزات على جانب الأنبوب. قم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخرزات في مخزن مؤقت لتوفير درجة حموضة مثالية لربط RBP-RNA.

عند التعرض للمغناطيس ، تتجمع الخرزات على جانب الأنبوب. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخرزات في محلول يحتوي على RBPs المستهدفة واحتضانها تحت التحريض.

RBPs المستهدفة أشكال التعرف على الحمض النووي الريبي التي تتعرف على تسلسل ARE وترتبط بالحمض النووي الريبي ، وبالتالي تشكل مركب بروتين الحمض النووي الريبي الثابت على الخرز.

تحت المجال المغناطيسي ، تتحرك الخرزات نحو المغناطيس دون إزعاج تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخرزات في مخزن مؤقت للشطف يحتوي على البيوتين.

يزيح البيوتين الديسثيوبيوتين من الخرز عن طريق الارتباط التنافسي بالستربتافيدين ، وبالتالي يخفف مركب البروتين والحمض النووي الريبي.

قم بتقييم وجود RBPs المستهدفة في الشطف لتأكيد تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي.

اغسل مسبقا 50 ميكرولترا من حبيبات الستربتافيدين المغناطيسية لكل 50 بيكومول من الحمض النووي الريبي. دوامة الأنبوب مع حبات الستربتافيدين المغناطيسية لمدة 15 ثانية. بعد الدوامة بسرعة، قم بإزالة 200 ميكرولتر في أنبوب قفل آمن نظيف سعة 1.5 ملليلتر باستخدام أطراف الماصة المقطوعة. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي بحيث تتجمع الخرزات على جانب الأنبوب ، وانتظر دقيقة واحدة. قم بإزالة سائل إعادة التعليق.

لغسل الخرز، قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي عند 400 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار، ومحلول كلوريد الصوديوم 0.05 مولار، وقم بإزالة الماصة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي وانتظر دقيقة واحدة ، ثم اجمع المادة الطافية.

اغسل الخرزات ب 200 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 100 مللي مولار ، وقم بإزالة المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من 20 مللي مولار. أعد تعليق الخرزات عن طريق سحب العينات وضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي. بعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي عند 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لالتقاط الحمض النووي الريبي 1x وإعادة تعليق حبات الستربتافيدين المغناطيسية عن طريق الدوامة لفترة وجيزة.

قم بإزالة 50 ميكرولترا من حبيبات الستربتافيدين المغناطيسية وأضفها إلى كل أنبوب RNA مسمى باستخدام طرف ماصة مقطوعة. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الأسطوانة. بعد أن يكون الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة ، قم بإزالة المادة الطافية. أضف 50 ميكرولترا من 20 مللي مولار تريس إلى الخرزات وأعد تعليقها. ثم ضع الأنابيب في الحامل المغناطيسي. بعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة المادة الطافية.

أضف 100 ميكرولتر من 1x مخزن مؤقت لربط البروتين والحمض النووي الريبي إلى الخرزات وأعد تعليقها. ثم ضع الأنابيب مرة أخرى في الحامل المغناطيسي. بمجرد أن تكون الأنابيب في الحامل لمدة 1 دقيقة ، اجمع المادة الطافية. أضف 100 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ب. أعد التعليق عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل وتجنب تكوين فقاعات. احتضان أنابيب التفاعل لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية على الأسطوانة.

انتقل إلى خطوات الغسيل والشطف. ضع الأنابيب في حامل مغناطيسي. اجمع التدفق وانقله إلى أنبوب جديد. ماصة 100 ميكرولتر من عازلة الغسيل 1X على الخرز. أعد التعليق برفق. ضعهم مرة أخرى في الحامل. انتظر دقيقة واحدة وتخلص من المادة الطافية. كرر الخطوة مرتين.

أضف 40 ميكرولترا من محلول الشطف إلى الخرز المغناطيسي. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل واحتضانها على شاكر أنبوبي. ضع الأنابيب في حامل مغناطيسي ، وانتظر دقيقة واحدة ، واجمع عينة الشطف. ضعه على الجليد واستخدمه لتحليل المصب.