اختبار الربط في المختبر القائم على SELEX لتحديد تفاعلات الحمض النووي الريبي والبروتين

التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي ، SELEX ، بتحديد تسلسلات الحمض النووي الريبي المرتبطة بالبروتين.

أولا ، احصل على تجمع RNA عشوائي يحتوي على RNAs ذات علامات إشعاعية مع تسلسلات عشوائية تطوى في هياكل عالية التحديد. احتضان مع البروتين المستهدف. يرتبط البروتين بجزيئات الحمض النووي الريبي ذات التسلسلات المحددة والهياكل ثلاثية الأبعاد ، بينما تظل الحمض النووي الريبي غير المحدد غير مرتبطة.

مرر الخليط عبر مرشح النيتروسليلوز. يمر الحمض النووي الريبي غير المرتبط عبر مسام المرشح ، بينما تظل مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي محتفظ بها.

قم بتقطيع المرشح المحتوي على مركب بروتين الحمض النووي الريبي إلى شظايا. كرر تفاعل الحمض النووي الريبي والبروتين عن طريق احتضان تجمع الحمض النووي الريبي بتركيز منخفض للبروتين المستهدف - مما يسمح فقط بربط تسلسل عالي التقارب ، بينما تفشل التسلسلات منخفضة التقارب في الارتباط.

قم بتحميل هذا الخليط على هلام بولي أكريلاميد وقم بإجراء الرحلان الكهربائي. تهاجر مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي ببطء عبر الجل مقارنة بالحمض النووي الريبي منخفض التقارب وغير المرتبط. يظهر تصوير هلام الأشعة السينية تحولا في النطاق يتوافق مع موقع مركب بروتين الحمض النووي الريبي.

قطعي جزء الجل المحتوي على المركب إلى شرائح. أضف Proteinase K إلى شظايا المرشح وشرائح الهلام ، وهضم البروتينات وإطلاق الحمض النووي الريبي من المجمع. أضف الفينول كلوروفورم وأجهزة الطرد المركزي ، وفصل الحمض النووي الريبي عن البروتينات المهضومة.

امزج المادة الطافية المحتوية على الحمض النووي الريبي مع أسيتات الصوديوم والإيثانول. أجهزة الطرد المركزي لتسريع الحمض النووي الريبي. أعد التعليق في ماء خال من RNase. نسخ الحمض النووي الريبي عكسيا لتكميلي الحمض النووي وتضخيم الحمض النووي تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

كرر عدة جولات من الفصل القائم على المرشح والهلام للحصول على مجموعة من تسلسلات الحمض النووي الخاصة بالبروتين المستهدف.

لربط البروتين والحمض النووي الريبي في حجم تفاعل يبلغ 100 ميكرولتر ، قم أولا بإعداد 10 ملليمولار تريس هيدروكلوريد عند درجة الحموضة 7.5 ، تحتوي على 50 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم ، ومليمولار DTT واحد ، و 0.09 ميكروغرام لكل ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار ، و 0.5 وحدة لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ، و 0.15 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ، و 1 مللي مولار EDTA. ثم أضف 30 ميكرولترا من البروتين المؤتلف PTB و 10 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي من البركة المناسبة.

ضع الأنابيب التي تحتوي على تفاعلات الربط في كتلة درجة حرارة لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتجزئة الحمض النووي الريبي المرتبط من الحمض النووي الريبي غير المرتبط من خلال أربع جولات من الاختيار والتضخيم. أولا ، قم بتصفية العينة سعة 100 ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة من خلال مرشح النيتروسليلوز المتصل بمشعب تفريغ. يبقى مركب بروتين الحمض النووي الريبي على المرشح.

باستخدام شفرة حلاقة معقمة ، قم بتقطيع الفلتر إلى أجزاء ، وأدخلها في أنبوب الطرد المركزي. اغمر قطع المرشح في محلول البروتيناز K وضعه على كوب لمدة ثلاث ساعات على الأقل أو طوال الليل لاستعادة الحمض النووي الريبي.

لإزالة البروتين من عينة الحمض النووي الريبي ، أضف حجما متساويا من الفينول كلوروفورم ، الدوامة. ثم جهاز الطرد المركزي بسرعة عالية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. احصل على المرحلة المائية ، واستخرج بالكلوروفورم مرة أخرى. بعد ذلك ، امزج المادة الطافية مع حجم 1/10 من أسيتات الصوديوم 3 مولي عند درجة الحموضة 5.2 ومجلدين إلى ثلاثة أحجام من الإيثانول المطلق.

اترك الأنبوب في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة عالية لمدة 10 دقائق. كرر خطوات الغسيل والتجفيف بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بإذابة الحمض النووي الريبي في المياه المعالجة ب DEPC. بعد الجولة الأولى من اختبار ربط المرشح ، قم بإجراء ثلاث جولات أخرى.

بعد ذلك ، قم بإجراء جولتين من النسخ والربط والتضخيم لفصل كسور الحمض النووي الريبي المرتبطة بالبروتين عن الكسور غير المرتبطة. صب جل بولي أكريلاميد أصلي بنسبة 5٪ مع نسبة 60 إلى 1 أكريلاميد ثنائي الساكريلاميد في عازلة TBE 0.5x. ثم قم بإعداد تفاعل ربط بروتين الحمض النووي الريبي.

ضع الجل في جهاز الرحلان الكهربائي مملوء بمحلول TBE 0.5x في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية. ضع 250 فولت لمدة 15 دقيقة ، وقم بماصة تفاعل الربط في آبار مختلفة. بعد ذلك ، قم بتجزئة الحمض النووي الريبي المرتبط من الحمض النووي الريبي غير المرتبط عن طريق تشغيل الرحلان الكهربائي عند 250 فولت لمدة ساعة إلى ساعتين.

بعد ذلك ، قم بتعريض الجل لفيلم الأشعة السينية وتحديد موقع الحمض النووي الريبي المرتبط باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي. اقطع شريحة الجل باستخدام الحمض النووي الريبي المرتبط وأدخلها في أنبوب. سحق شريحة الجل واحتضانها في محلول البروتيناز K لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل. كرر الاستخراج باستخدام الفينول كلوروفورم والكلوروفورم ، كما هو موضح سابقا. قم بتصنيع (كدنا) من الحمض النووي الريبي المذاب.

قم بإعداد 20 ميكرولترا من التفاعل ، بما في ذلك ميكرولترين من المخزن المؤقت 10x RT ، وميكرولترين من النسخ العكسي AMV ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، و 5 ميكرولترات من الماء ، و 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المذاب. احتضن عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

تضخيم (كدنا) باستخدام 20 إلى 25 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح سابقا. كرر عملية تخليق الحمض النووي الريبي ، وربط البروتين ، وفصل الكسور المرتبطة بالبروتين وغير المرتبطة.