مقايسة الربط التنافسي لتحديد المركبات التي تعطل تفاعلات المستقبلات والترابط

يحدد اختبار الربط التنافسي الجزيئات الصغيرة التي تعطل تفاعلات المستقبلات والترابط من خلال الارتباط التنافسي بمستقبل مستهدف ، مما يثبط ارتباط الترابط الطبيعي.

لتحديد تفاعلات المستقبل مع الترابط الطبيعي في وجود مضاد جزيئي صغير خاص بالمستقبلات ، ابدأ بتعليق خلايا الخلايا الليمفاوية التائية البشرية التي تعبر عن المستقبل المستهدف.

أضف معلق الخلية إلى آبار صفيحة متعددة الآبار تحتوي على تركيزات متزايدة من المضاد. حضن. يرتبط المضاد بموقع الارتباط التقويمي — موقع ربط الترابط الطبيعي للمستقبل.

أضف تركيزا ثابتا من الروابط الطبيعية المسماة بالفلورسنت إلى الآبار. حضن.

عند التركيزات المنخفضة ، تحتل المضادات عددا قليلا من مواقع الربط التقويمي ، مما يسمح بالارتباط الطبيعي بالمستقبلات. ومع ذلك ، عند التركيزات العالية ، يحتل الخصوم معظم مواقع الربط التقويمي ، مما يسمح بالحد الأدنى من ارتباط مستقبلات الترابط الطبيعي.

جهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في بارافورمالدهيد لإصلاحها ، مع الحفاظ على التشكل الخلوي.

باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، قم بتحليل إشارات التألق من الخلايا الليمفاوية التائية الفردية التي تعبر عن المستقبلات المرتبطة بالمضاد والفلورسنت.

الانخفاض المعتمد على الجرعة في متوسط شدة التألق مع زيادة تركيزات المضاد الخاص بالمستقبلات إلى ارتباط تنافسي للمضادات بمواقع ربط المستقبلات التقويمية ، مما يثبط التفاعل الطبيعي بين الترابط والمستقبلات.

للبدء ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من المحلول المركب في صفيحة شفافة ذات قاع دائري 96 بئرا وفقا لتخطيط تجريبي محدد مسبقا.

أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية من خزان الكاشف إلى اللوحة التي تتكون من 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من 100 نانوجرام لكل مليلتر CXCL12 المصنف بالفلورسنت من خزان كاشف مماثل إلى آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة المكونة من 96 بئرا عند 400 ضعف الجاذبية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية من الخلايا المحببة عن طريق التقليب فوق اللوحة. جفف الطبق على منديل ورقي. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الفحص الجديد، من خزان الكاشف إلى الآبار باستخدام ماصة متعددة القنوات.

انتقل على الفور إلى الطرد المركزي للوحة مرة أخرى لمدة 5 دقائق عند 400 ضعف الجاذبية في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق التقليب فوق الطبق ثم تجفيفها على منديل ورقي. أخيرا ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية برفق في 200 ميكرولتر من 1٪ بارافورمالدهايد مذاب في PBS. ستعمل هذه الخطوة على إصلاح الخلايا.

لتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ابدأ تشغيل الجهاز ، وافتح البرنامج المقابل. حدد المعلمات الخلوية المراد تصورها بتنسيق لطخة نقطية كمنطقة مبعثر أمامية ومنطقة تشتت جانبية وقناة الكشف عن الفلوروفور في عرض الرسم البياني.

اختر عينة واحدة ، على سبيل المثال ، عينة تحكم سلبية ، لإجراء بوابات لمجموعة خلايا متجانسة محددة بناء على معلمات التشتت الأمامي والمبعثر الجانبي. قم بتكييف إعدادات تحميل الخلايا في جهاز قياس التدفق الخلوي.

اختر ثلاثة خلطات قبل الحقن. حدد الحقن التلقائي ل 100 ميكرولتر من الخلايا الثابتة ، واستخدم معدل تدفق عينة يبلغ 1.5 ميكرولتر في الثانية. قم بتشغيل العينة عن طريق تحديد "الحصول على البيانات". ستظهر الآن معلمات التشتت الأمامي والمبعثر الجانبي لهذه العينة بالإضافة إلى اكتشاف الفلوروفور على الشاشة.

الآن ، حدد أداة بوابة البرنامج. استنادا إلى تصور مخطط اللطخة النقطية المبعثرة الأمامية والمبعثر الجانبي ، حدد مسبقا مجموعة خلايا متجانسة وقابلة للحياة عن طريق البوابات. حدد لتحليل 20,000 "حدث" لكل عينة.

هذا يعني أنه لكل عينة ، سيتم تحليل 20,000 خلية تقع ضمن بوابة محددة مسبقا في النهاية. سيستمر الحصول على البيانات حتى يتم الوصول إلى هذا العدد من الأحداث.

ابدأ الجري عن طريق تحديد الآبار المراد تحليلها أولا. ثم حدد "تشغيل الآبار".

سيقوم جهاز قياس التدفق الخلوي الآن بتحليل هذه العينات واحدة تلو الأخرى عن طريق تسجيل متوسط شدة التألق لكل عينة ، وهو ما يتوافق مع متوسط إشارة الفلورسنت من 20,000 خلية تقع ضمن البوابة المحددة مسبقا.

أخيرا ، قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح في البروتوكول.