الهندسة الحيوية شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان في الفئران العوز المناعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء شبكة وعائية بشرية داخل الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك من خلال استزراع الخلايا المكونة للمستعمرات البطانية المشتقة من دم الإنسان والخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من نخاع العظم البشري أولاً. بعد ذلك، يتم خلط كلا النوعين من الخلايا في هلام قائم على الكولاجين، ثم يُحقن تحت الجلد في فأر ناقص المناعة.

بعد سبعة أيام، يتم استخراج الغرسة وتقييمها للتحقق من تكوين شبكة وعائية بشرية. وفي النهاية، يمكن التحقق من وجود أوعية دموية دقيقة خاصة بالبشر داخل الغرسات من خلال الفحص النسيجي والكيمياء النسيجية المناعية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطريقة أخرى مثل الزرع الجراحي للمنشأ في أنها بسيطة وسهلة التنفيذ، ولا تتطلب تدخلاً جراحياً.

ابدأ بإذابة أنبوب واحد من E CFCs وقم فوراً بتخفيف الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من DMEM. قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا بسرعة 1200 RPM لمدة خمس دقائق، ثم أعد تعليق كتلة الخلايا في 10 ملليلتر من وسط EGM two الدافئ. بعد ذلك، انقل الخلايا إلى طبق زراعة أنسجة مقاس 100 ملليمتر مطلي بـ 1%gelatin، واحضن الخلايا طوال الليل في حاضنة مرطبة.

في صباح اليوم التالي، قم بشفط الوسط وأي خلايا غير مرتبطة برفق. ثم قم بتغذية الخلايا المرتبطة بـ 10 milliliters من وسط E GM two الطازج. استمر في هذه العملية على مدار الأيام القليلة القادمة حتى تتشكل طبقة أحادية متصلة.

ثم اغسل الخلايا بـ 10 milliliters من PBS. استبدل PBS بـ 2 milliliters من tripsin EDTA وأعد الطبق إلى الحاضنة لمدة خمس دقائق. بعد مرور خمس دقائق، انقر برفق على الطبق تحت المجهر وتحقق مما إذا كانت الخلايا قد انفصلت.

إذا لم يحدث ذلك، كرر عمليات الحضن القصيرة مع الرج اللطيف. وبمجرد انفصال الخلايا تماماً، أضف ثمانية ملليمترات من وسط EGM two إلى الخلايا وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليمتر. قم بعدّ الخلايا ثم قم بطردها مركزياً عند 1200 RPM لمدة خمس دقائق.

الآن، قم بزراعة الخلايا على أطباق زراعة الأنسجة المطلية بـ 1% gelatin بكثافة استزراع تبلغ 5,000 خلية لكل سنتيمتر مربع. قم بتحضين الخلايا في وسط EGM two، وقم بتغذيتها كل يومين إلى ثلاثة أيام باستخدام وسط EGM two. كرر هذا الإجراء في الممرات اللاحقة ما بين الممر الرابع والثامن.

ستكون خلايا E CFCs جاهزة للاستخدام. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضاً لزراعة خلايا MSCs، وذلك ببساطة عن طريق استبدال وسط E GM two بوسط M-S-C-G-M.

استخدم طبق زراعة غير مطلي. ابدأ عملية إعادة الزرع عند وصول الخلايا إلى 80% من الالتحام، وأعد الزرع بكثافة استزراع تبلغ 10, 000 خلية لكل سنتيمتر مربع. تتطلب هذه التجربة 800, 000 من خلايا E CFCs و 1, 200, 000 من خلايا MSCs لكل غرسة.

بشكل عام، يتم تحضير خمس غرسات في وقت واحد. للبدء، يتم سحب الوسط الخلوي من أطباق الزرع، وغسل كل طبق من الخلايا بـ 10 milliliters من PBS. استبدل PBS بـ two milliliters من trypsin EDTA وحضن الأطباق مع الرج اللطيف.

افحص الخلايا تحت المجهر كل دقيقتين إلى خمس دقائق حتى تنفصل جميع الخلايا. بعد ذلك، أضف 8 mL من DMEM واجمع محلول الخلايا. وفي أنبوب مخروطي سعة 15 mL، قم بعدّ الخلايا وانقل عدداً كافياً من الخلايا لخمس غرسات إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 15 mL.

ثم قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1200 RPM لمدة خمس دقائق وأزل السائل الطافي. قم بتحضير خليط من الفيبرينوجين والكولاجين والفيبرونيكتين بعناية على الثلج. بعد ذلك، أعد تعليق كتلة الخلايا برفق شديد في الخليط المبرد على الثلج.

قم بتحميل معلق الخلايا في حقنة سعة 1 مل مع تجنب تكوين فقاعات هوائية، ثم ثبّت إبرة مقاس 26 ذات غطاء. احتفظ بالحقنة المحملة على الجليد حتى يتم حقن خليط الخلايا. تم تخدير أربعة فئران عارية ناقصة المناعة وغير تيموسية (athymic nude immunodeficient) بعمر ستة أسابيع باستخدام غرفة ISO fluorine.

بمجرد تخدير الفئران وعدم استجابتها لقرصة إصبع القدم، ابدأ بعمليات الحقن لكل فأر. استخدم إبرة عيار 30 لحقن 50 µL من محاليل الثرومبين تحت الجلد في المنطقة الظهرية العلوية. وفي الموقع نفسه، احقن 200 µL من خليط الخلايا.

باستخدام إبرة قياس 26 gauge، ستتجلط الجزيئات الكبيرة المحقونة وتشكل نتوءاً صغيراً ولكن ملحوظاً تحت الجلد. بعد الحقن، ضع الفئران على طبقة من الشاش لضمان راحتها وتدفئتها. راقبها حتى تستعيد قدرتها على الحركة.

على مدار الأيام الثلاثة التالية، قم بإجراء ملاحظة يومية للحالة الصحية العامة للحيوان. وبعد مرور أسبوع واحد من الحقن، قم بقتل الفئران رحمانياً باستخدام ثاني أكسيد الكربون واستأصل سدادة الهلام جراحياً. وبمجرد استخراجها، قم بتصوير سدادات الهلام بجانب مسطرة، ثم ضع كل سدادة هلام في كاسيت نسيجي واغمرها في 10%neutral buffered formin طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

في اليوم التالي، اغسل الفورمالين المنظم المتعادل بتركيز 10% بالماء المقطر. احفظ الكاسيتات في PBS عند درجة حرارة أربع درجات Celsius حتى يتم تقييمها نسيجياً. قم بعمل قطاعات بسمك سبعة ميكرون من الغرسة المدمجة في البارافين.

بعد ذلك، قم بقياس كثافة الأوعية الدقيقة في الجزء الأوسط من الغرسات. وباستخدام صبغة H and e، قم بحساب عدد الأوعية لكل مليمتر مربع لإثبات الطبيعة البشرية للأوعية المجهرية. قم بصبغ المقاطع باستخدام جسم مضاد anti-human CD 31 متاح تجارياً بتخفيف واحد إلى 100.

تظهر صورة تباين الطور هذه المورفولوجيا المرصوفة المميزة للخلايا البطانية في طبقة أحادية متلاصقة نموذجية من الخلايا الجذعية البطانية المشتقة من دم الحبل السري (e CFCs). وتظهر هذه الصورة المورفولوجيا المغزلية النموذجية للخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSCs) المشتقة من نخاع العظم البشري. وبعد فترة حضانة استمرت لمدة أسبوع في المضيف الفأر، بدا الغرس الملحوظ بخط متقطع أصفر مختلفاً تماماً عن أنسجة المضيف عند التكبير العالي.

ظهرت أوعية دقيقة متعددة تكشف عن هياكل تجويفها التي تحتوي على كريات دم حمراء، وهي موضحة برؤوس السهام الصفراء. وعند فحص السدادات كيميائياً نسيجياً مناعياً، كانت تجاويف الأوعية الدقيقة تفاعلية تجاه جسم مضاد أحادي النسيلة لـ CD 31 البشري. وقد صُبغت نوى الخلايا صبغة تباينية باستخدام الهيماتين.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها خلال أونصة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.