اختبار السمية الخلوية بوساطة البروتين البكتيري خارج الخلية على PMNs
JoVE Encyclopedia of Experiments
علم المناعة
0 مشاهدات • 3:14 د • July 8th, 2025
خذ مزرعة المكورات العنقودية الذهبية، وهي بكتيريا مسببة للأمراض تفرز الليوكوسيدين - وهو سم مكون للمسام - يتكون من مكونات S و F أحادية.
حبيبات الخلايا وتخفيف المادة الطافية بشكل متسلسل. انقل المادة الطافية المحتوية على الكريات البيض إلى صفيحة دقيقة تحتوي على كريات البيض متعددة الأشكال ، أو PMNs ، واحتضنها.
يرتبط المكون S بمستقبلات غشاء محددة على PMNs ، متبوعا بقلة القلة غير المتجانسة مع مكون F لإدخاله في غشاء الخلية ، مما يؤدي إلى تكوين المسام.
تسبب المسام انخفاضا في أيونات البوتاسيوم داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى تنشيط بروتين 3 أو NLRP3 من عائلة البيرين العائلي NLR.
NLRP3 يرتبط ببروتين يشبه البقع المرتبط بموت الخلايا المبرمج يحتوي على مجال تجنيد كاسباز ، أو ASC ، الذي يجند pro-caspase-1 ، مكونا التهابا.
يؤدي التحلل البروتيني التلقائي إلى تحويل pro-caspase-1 إلى caspase-1 النشط، مما يؤدي إلى موت الخلايا.
حصاد الخلايا على فترات محددة. أضف يوديد البروبيديوم أو PI ، الذي يدخل الخلايا الميتة من خلال الأغشية التالفة لربط الحمض النووي ، مما ينبعث منه تألق.
باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حدد الخلايا الملطخة ب PI لتقييم التأثير السام للخلايا لكل من تركيز الليوكوسيدين ووقت الحضانة.
استزراع المكورات العنقودية الذهبية بين عشية وضحاها في الوسائط المناسبة ، باستخدام حاضنة اهتزاز مثبتة عند 37 درجة مئوية في اليوم السابق للتجربة. الاستزراع الفرعي S. aureus عن طريق إجراء تخفيف من 1 إلى 100 من مزارع البكتيريا الليلية باستخدام وسائط جديدة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج حتى تصل البكتيريا إلى مرحلة النمو الثابتة المبكرة. بعد خمس ساعات من النمو ، انقل 1 ملليلتر من الزراعة الفرعية S. aureus إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي بوزن 5000 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد الطرد المركزي ، استنشاق المواد الطافية. مرر المواد الطفية المستنشقة من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر ، وضعه على الثلج. إجراء عمليات تخفيفات متسلسلة من المادة الطافية باستخدام وسائط مثلجة باردة تستخدم لاستزراع المكورات العنقودية الذهبية. أضف برفق عينات طافية أو وسائط بمفردها للتحكم السلبية والإيجابية إلى الآبار الفردية المكونة من 96 بئرا تحتوي على PMNs والجليد كما هو موضح سابقا.
صفيحة صخرية برفق لتوزيع المواد الطافية والآبار ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية. في الأوقات المرغوبة ، أخرج الطبق من الحاضنة وضعه على الثلج. أضف 300 ميكرولتر من DPBS المثلج الذي يحتوي على 1 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم إلى كل أنبوب قياس التدفق الخلوي. انقل العينات إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي على الجليد. للحصول على بئر التحكم الإيجابي ، أضف 20 ميكرولترا من 10٪ Triton X إلى العينة قبل نقلها إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. تحليل تلطيخ يوديد البروبيديوم ل PMNs المخمورة باستخدام قياس التدفق الخلوي.
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في التأثيرات السامة للخلايا لـ leukocidin، وهو سم تنتجه بكتيريا Staphylococcus aureus، على الكريات البيضاء متعددة النوى (PMNs). وتتضمن الآلية تكوين ثقوب في الـ PMNs مما يؤدي إلى موت الخلايا، وقد تم تقييم ذلك عن طريق قياس التدفق الخلوي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- بيولوجيا الخلية
- علم السموم
خلفية علمية
- تُعد بكتيريا Staphylococcus aureus بكتيريا ممرضة.
- يُعتبر اللوكوسيدين (Leukocidin) سمًّا مُكوّنًا للمسام يؤثر على الخلايا المناعية.
- إن فهم آلية عمل اللوكوسيدين يمكن أن يساهم في تطوير الاستراتيجيات العلاجية.
- يُستخدم قياس التدفق الخلوي (Flow cytometry) لتقدير كمية موت الخلايا.
الهدف من الدراسة
- لتوضيح آلية السُمية الخلوية الناتجة عن الليوكوسيدين.
- لتقييم تأثيرات تركيز الليوكوسيدين ووقت الحضن على الخلايا متعددة النوى في الدم المحيطي (PMNs).
- لاستخدام قياس التدفق الخلوي لتقدير كمية موت الخلايا.
الطرق المستخدمة
- زراعة وتخفيف بكتيريا Staphylococcus aureus.
- حضن الخلايا المتعادلة polymorphonuclear (PMNs) مع طافي يحتوي على الليوكيسيدين.
- استخدام يوديد البروبيديوم لصبغ الخلايا الميتة.
- استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل حيوية الخلايا.
النتائج الرئيسية
- يؤدي الليوكوسيدين إلى تكوين ثقوب في الخلايا متعددة الأشكال ذات النواة (PMNs).
- يرتبط موت الخلايا بتركيز الليوكوسيدين.
- يحدد قياس التدفق الخلوي التأثيرات السامة للخلايا بشكل فعال.
- يُلاحظ تنشيط الجسيم الالتهابي NLRP3.
الاستنتاجات
- يعتبر الليوكوسيدين المستخلص من Staphylococcus aureus ساماً للخلايا بالنسبة للخلايا المتعادلة (PMNs).
- تقدم هذه الدراسة رؤى حول آلية التهرب المناعي.
- قد تساهم النتائج في تطوير علاجات للعدوى التي تسببها S. aureus.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح التقييم الكمي للسمية الخلوية التي تتوسطها البروتينات البكتيرية خارج الخلية في الخلايا متعددة الأشكال النوى (PMNs) البشرية تقليل المخاطر الميكانيكية في عملية التحقق من أهداف الأمراض المعدية. يوفر هذا المقاييس ثقة تنبؤية لتقييم استراتيجيات التملص المناعي التي تتبعها المسببات المرضية، مما يدعم اتخاذ القرارات في المراحل المبكرة من محافظ البحث والتطوير للمضادات المعدية. كما أن دمج قراءات السمية الخلوية القائمة على قياس التدفق الخلوي يعزز الاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف إلى مرحلة اختيار النماذج قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في أبحاث وتطوير الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- يُمكّن من استقصاء آليات السموم البكتيرية التي تؤثر على حيوية الخلايا المناعية.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف البروتينية المشتقة من المسببات المرضية في التفاعلات بين المضيف والمسبب المرضي.
- يوفر بيانات كمية لتقليل المخاطر الميكانيكية لاستراتيجيات مكافحة الضراوة.
- يسهل فرز الأهداف المرشحة بناءً على ملفات السمية الخلوية.
الفحص وتطوير المقايسة
- تأسيس مقايسة كمية قابلة للتكرار لسمية البروتينات خارج الخلوية.
- توحيد قراءات قياس التدفق الخلوي لسير عمل الفحص عالي المحتوى.
- تمكين المقارنة القوية بين تركيزات السموم وأوقات الحضانة عبر ظروف مختلفة.
- تجهيز أنظمة بيولوجية مصادق عليها لتقييم المركبات في المراحل اللاحقة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يربط بيانات السمية الخلوية في المختبر (in vitro) باستجابات الخلايا المناعية ذات الصلة بالمرض.
- يدعم الاستمرارية من نتائج مرحلة الاكتشاف إلى نماذج العدوى قبل السريرية.
- يوجه التقدم المعدل حسب المخاطر للمرشحات المضادة للعدوى التي تستهدف التهرب المناعي.
- يوفر رؤية ميكانيكية لتطوير المؤشرات الحيوية الانتقالية.
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
يتموضع هذا المقايسة ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، حيث تعمل كجسر يربط بين التحقق الميكانيكي من الهدف واختيار النموذج الانتقالي لبرامج مكافحة العدوى.
- بيولوجيا الاكتشاف: قياس السمية الخلوية للخلايا متعددة الأشكال النووية (PMN) لتوضيح وظيفة البروتينات البكتيرية ومسارات التهرب المناعي.
- الفحص المسحي: تقديم نتائج قياس التدفق الخلوي معيارية وقابلة للتكرار لإجراء التحليلات المقارنة.
- التحليلات: توفير قياسات كمية للمتغيرات التابعة للتقييم الإحصائي لتأثيرات السمية الخلوية.
- الأبحاث الانتقالية: ربط استجابات الخلايا المناعية في المختبر بنقاط النهاية لنماذج العدوى قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفير منصة مقايسة قابلة لإعادة الاستخدام لمختلف السموم البكتيرية وأنواع الخلايا المناعية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف وتقلل من الغموض الميكانيكي في دراسات المضيف والممرض.
- القيمة التشغيلية: تعزز توحيد المقاييس، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع للاستخدام عبر البرامج المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) وكفاءة رأس المال من خلال تمكين التقييم المبكر للمخاطر البيولوجية.
- التأثير على المحفظة: تدعم ترتيب الأولويات المعدلة وفقاً للمخاطر وتطوير الأصول المضادة للعدوى التي تستهدف التهرب المناعي.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في قياس التدفق الخلوي والتعامل مع الخلايا المناعية.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة ومرافق تحليلية معتمدة.
- يستلزم توحيد بروتوكولات المقاييس والضوابط بين الفرق المختلفة.
- قابل للتكييف مع السموم البكتيرية ومجموعات الخلايا المناعية المختلفة من خلال تحسين البروتوكول.
- يعتمد على توفر الخلايا متعددة الأشكال النووية (PMNs) البشرية ذات الجودة العالية والرواسب البكتيرية الطافية.
الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية
تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
أسلوب Fluorescence المستندة إلى دراسة تنظيم الجينات البكتيرية في الأنسجة المصابة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فحوصات موحدة في المختبر لتصور وتحديد التفاعلات بين العدلات البشرية والمكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فحص السمية الخلوية لسلالات المكورات العنقودية الذهبية على العدلات بعد البلعمة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
عزل خلايا ماست المستمدة من الغشاء البريتوني وعلى التوصيف الوظيفي مع Ca2 +-التصوير وفحوصات تحبب
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
تحديد كميه السمية الخلوية للسبحيه الذهبية ضد الكريات البيضاء البشرية الاحاديه النواة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 29 أغسطس 2026