اختبار السمية الخلوية بوساطة البروتين البكتيري خارج الخلية على PMNs

خذ مزرعة المكورات العنقودية الذهبية، وهي بكتيريا مسببة للأمراض تفرز الليوكوسيدين - وهو سم مكون للمسام - يتكون من مكونات S و F أحادية.

حبيبات الخلايا وتخفيف المادة الطافية بشكل متسلسل. انقل المادة الطافية المحتوية على الكريات البيض إلى صفيحة دقيقة تحتوي على كريات البيض متعددة الأشكال ، أو PMNs ، واحتضنها.

يرتبط المكون S بمستقبلات غشاء محددة على PMNs ، متبوعا بقلة القلة غير المتجانسة مع مكون F لإدخاله في غشاء الخلية ، مما يؤدي إلى تكوين المسام.

تسبب المسام انخفاضا في أيونات البوتاسيوم داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى تنشيط بروتين 3 أو NLRP3 من عائلة البيرين العائلي NLR.

NLRP3 يرتبط ببروتين يشبه البقع المرتبط بموت الخلايا المبرمج يحتوي على مجال تجنيد كاسباز ، أو ASC ، الذي يجند pro-caspase-1 ، مكونا التهابا.

يؤدي التحلل البروتيني التلقائي إلى تحويل pro-caspase-1 إلى caspase-1 النشط، مما يؤدي إلى موت الخلايا.

حصاد الخلايا على فترات محددة. أضف يوديد البروبيديوم أو PI ، الذي يدخل الخلايا الميتة من خلال الأغشية التالفة لربط الحمض النووي ، مما ينبعث منه تألق.

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، حدد الخلايا الملطخة ب PI لتقييم التأثير السام للخلايا لكل من تركيز الليوكوسيدين ووقت الحضانة.

استزراع المكورات العنقودية الذهبية بين عشية وضحاها في الوسائط المناسبة ، باستخدام حاضنة اهتزاز مثبتة عند 37 درجة مئوية في اليوم السابق للتجربة. الاستزراع الفرعي S. aureus عن طريق إجراء تخفيف من 1 إلى 100 من مزارع البكتيريا الليلية باستخدام وسائط جديدة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج حتى تصل البكتيريا إلى مرحلة النمو الثابتة المبكرة. بعد خمس ساعات من النمو ، انقل 1 ملليلتر من الزراعة الفرعية S. aureus إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، وجهاز طرد مركزي بوزن 5000 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي ، استنشاق المواد الطافية. مرر المواد الطفية المستنشقة من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر ، وضعه على الثلج. إجراء عمليات تخفيفات متسلسلة من المادة الطافية باستخدام وسائط مثلجة باردة تستخدم لاستزراع المكورات العنقودية الذهبية. أضف برفق عينات طافية أو وسائط بمفردها للتحكم السلبية والإيجابية إلى الآبار الفردية المكونة من 96 بئرا تحتوي على PMNs والجليد كما هو موضح سابقا.

صفيحة صخرية برفق لتوزيع المواد الطافية والآبار ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية. في الأوقات المرغوبة ، أخرج الطبق من الحاضنة وضعه على الثلج. أضف 300 ميكرولتر من DPBS المثلج الذي يحتوي على 1 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم إلى كل أنبوب قياس التدفق الخلوي. انقل العينات إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي على الجليد. للحصول على بئر التحكم الإيجابي ، أضف 20 ميكرولترا من 10٪ Triton X إلى العينة قبل نقلها إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. تحليل تلطيخ يوديد البروبيديوم ل PMNs المخمورة باستخدام قياس التدفق الخلوي.