تقييم السمية الخلوية وسلامة الغشاء في شرائح الرئة عن طريق فحص نازعة هيدروجين اللاكتات

ابدأ بشرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة ، PCLS ، المعالجة بعوامل سامة للخلايا مثل جزيئات الفاعل بالسطح في صفيحة متعددة الآبار.

يتم إدخال الفاعل بالسطح في الطبقة الدهنية الثنائية للخلية ، مما يتسبب في تفاعل ذيول الكارهة للماء للفاعل بالسطح مع النواة الكارهة للماء للطبقة الدهنية الثنائية.

وبالتالي ، فإن الترتيب المنظم لجزيئات الدهون مضطرب ، مما يؤدي إلى تكوين مذيلة.

هذا يضر بسلامة الغشاء ، مما يتسبب في تسرب المحتويات داخل الخلايا بما في ذلك نازعة هيدروجين اللاكتات أو LDH ، وهو مؤشر شائع لتلف غشاء الخلية.

اجمع المادة الطافية التي تحتوي على LDH التي تم إطلاقها.

أضف كوكتيل تفاعل فحص LDH الذي يحتوي على ركيزة اللاكتات و NAD + والديافوراز وملح التيترازوليوم ، واحتضنه.

يؤكسد LDH اللاكتات إلى البيروفات ، مع التقليل المتزامن من NAD + الإنزيم المساعد إلى NADH.

يستخدم Diaphorase NADH لتقليل ملح التيترازوليوم إلى فورمازان - منتج ملون.

يمكن قياس السمية الخلوية التي يسببها الفاعل بالسطح من نشاط LDH المشار إليه بإنتاج الفورمازان.

بعد احتضان PCLS مع أو بدون عوامل اختبار ، انقل 50 ميكرولترا من المادة الطافية والتكرارات إلى لوحة جديدة مكونة من 96 بئرا. هذا يولد نسخا مكررة من كل بئر معالج من صفيحة 24 بئرا.

مباشرة قبل الفحص ، قم بإعداد مزيج رئيسي لمحلول العمل لكاشف LDH عن طريق خلط 125 ميكرولتر من محلول المحفز مع 6.25 مل من محلول الصبغة للوحة 96 بئرا. بعد ذلك ، قم بوضع 50 ميكرولترا من محلول عمل الخلط الرئيسي في كل بئر يحتوي بالفعل على 50 ميكرولترا من المادة الطافية ، واحتضن اللوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك ، قم بقياس امتصاص كل بئر عند 492 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، واطرح الامتصاص عند مرجع 630 نانومتر من ذلك عند 492 نانومتر.