الفئران الفحص مساريق الأوعية الدموية

أهلاً بكم في قسم علم الأمراض في مستشفى جامعة GaN في غوتنبرغ، السويد. أنا الدكتور Klaus Norby، والطريقة التي ستشاهدونها قد تم تطويرها في مختبري. إن تكوين الأوعية الدموية ذي الصلة سريريًا، والذي يحدث بالتزامن مع نقص الأكسجة، أو الأورام الصلبة، أو أي مرض آخر متعلق بتكوين الأوعية، يحدث بشكل حصري تقريبًا في الأنسجة الموعاة طبيعيًا. في القوارض الصغيرة البالغة، يحتوي المساريق، الذي يربط الأمعاء الدقيقة بالجدار الخلفي للجسم، على عدد من الأجزاء الغشائية الرقيقة. وفي الجرذان، يوجد ما يقرب من 40 إلى 50 من هذه النوافذ المساريقية. وهي شفافة تمامًا وبالتالي تبدو كالنوافذ للعين المجردة، وكل نافذة محاطة بنسيج دهني في ذكور الجرذان البالغة.

تتميز النوافذ المساريقية بأنها مُوعاة طبيعياً وتفتقر إلى عملية تكوين أوعية دموية فسيولوجية يمكن قياسها. وبذلك، فهي توفر فرصة لدراسة تكوين أوعية دموية جديدة (de novo angiogenesis) في أنسجة ثديية مُوعاة طبيعياً لدى البالغين. أي أنها تتيح دراسة بدء استجابة وعائية كاملة من الصفر، وتجاوز مثبطات تكوين الأوعية التي تعمل داخلياً في النسيج المختبر كما هو الحال في جميع الأنسجة الطبيعية في الفئران؛ حيث تغيب الأوعية الدقيقة الأصلية التي يمكن أن تعمل كأوعية دقيقة أم في العديد من النوافذ، مما يجعل الاختبار للأسف غير قابل للتنبؤ به في الفئران في شكلها الطبيعي.

تحتوي النوافذ المساريقية في الجرذان عادةً على عدد صغير نسبيًا من الأوعية الدموية الصغيرة الموجودة في المحيط لدى الجرذان البالغة. وتتراوح سماكة هذه النوافذ المساريقية طبيعيًا بين 5 و 10 ميكرومتر فقط. وهذا يسمح بفرد الأنسجة السليمة على الشرائح وفحصها مجهريًا، مما يتيح رؤية جميع الأوعية في كل نافذة ويمنح الأوعية امتدادًا ثنائي الأبعاد بشكل أساسي.

توفر هذه الطريقة فرصة لا مثيل لها لإجراء قياسات كمية للمدى المكاني، والكثافة، وتكوين النمط، وحجم الأوعية الدموية الدقيقة. ويعد الموقع تحت الجلد شائعاً لدراسات تكوّن الأوعية الدموية، ومع ذلك، وبسبب عدم تجانس الخلايا البطانية والخصائص النوعية للأنسجة، فإن السيطرة على تكوّن الأوعية الدموية في الأنسجة تحت الجلد، وكذلك في الأورام التي تنمو تحت الجلد، قد لا تتنبأ بالسيطرة على تكوّن الأوعية الدموية في الأعضاء الحشوية التي تنتقل إليها النقائل السرطانية مثل الرئة، والكبد، والعظام، والدماغ. وهذا أمر جدير بالملاحظة لأن النقائل الحشوية هي المسؤولة عادةً في نهاية المطاف عن فتك السرطان.

إن حقيقة كون النافذة المساريقية حشوية يجب أن تكون ميزة في هذا الصدد. يهدف مشروعنا إلى دراسة جوانب تكوين الأوعية الدموية الجديدة (de novo angiogenesis) بشكل كمي. ولذلك، نقوم بحقن عامل معروف محفز لتكوين الأوعية الدموية أو مادة اختبارية داخل الصفاق.

نقوم عادةً بحقن خمسة ملليلترات في المرة الواحدة في الجرذان البالغة غير المخدرة. يؤدي حجم كهذا من السائل إلى تعريض المساريقا بأكملها بسرعة للسائل المحقون. إن أي محلول يتم حقنه داخل الصفاق، بشرط ألا يكون حجمه ضئيلاً، يجب أن يؤثر على جميع الخلايا في النسيج المختبر، خاصة وأن طبقة الخلايا الميزوثيلية التي تغطي النافذة المساريقية الرقيقة للغاية عالية النفاذية للمواد المذابة. وبما أنه لا توجد عملية جراحية، فإن تكوّن الأوعية الدموية المراد دراسته في النافذة المساريقية لا يتأثر بتكوّن الأوعية الناجم عن التئام الجروح، لذا يتم إعطاء العلاج المحفز لتكوّن الأوعية الدموية على شكل حقن داخل الصفاق.

لأسباب عملية، نستخدم بروتوكول علاج يتكون من حقنتين يومياً على مدار فترة خمسة أيام، من صباح الاثنين إلى صباح الجمعة، وهو الإجراء المتبع عند دراسة التأثيرات المكونة للأوعية لبروتينات محددة مثل VEGF 1 65 و1 64 وbasic FGF، على سبيل المثال. وعادةً ما يُستخدم Pharmacia infusion solution كمادة حاملة. قد يبدو عدد العلاجات كبيراً، ولكن قد ثبت أنه ليس من الممكن دائماً تحفيز تكوين أوعية دموية ذات دلالة إحصائية حتى عند استخدام عوامل قوية محفزة لتكوين الأوعية مثل VEGF وbasic FGF عندما يتم إعطاؤها بمستويات فسيولوجية تقريبية في جرعة واحدة أو بضع جرعات متباعدة؛ إذ يجب تذكر أن هناك مثبطات داخلية قوية لتكوين الأوعية تعمل داخل الأنسجة.

تحاكي عملية إعطاء الوسائل العلاجية المعدلة لتكون الأوعية الدموية حالة علاجية سريرية. حيث يمكن إعطاء واحد أو أكثر من العوامل المعدلة لتكون الأوعية الدموية بشكل جهازي، أو تحت الجلد، أو عن طريق الوريد، أو عن طريق الفم. على سبيل المثال.

يحاكي هذا الإجراء حالة العلاج السريري من حيث إمكانية دراسة تأثير الجزيء الأصلي ونواتج أيضه أيضاً. ويسمح هذا النظام بدرجة معينة من التحكم في الآثار السامة للعوامل المعدلة لتكون الأوعية الدموية التي يتم إعطاؤها جهازياً. وبما أن الجرذان البالغة تنمو فسيولوجياً ويمكن أن تزداد أوزانها بنسبة تصل إلى 40% خلال تجربة تستمر لمدة أسبوعين أو ثلاثة أسابيع، فمن الممكن من خلال وزن الحيوانات فهم الدرجة التي أدى بها العلاج إلى إبطاء الزيادة في وزن الجسم، والتي يمكن اعتبارها تعبيراً عن الآثار السامة.

يتيح ذلك تحديد الجرعات السامة في اختبارات تعديل تكوين الأوعية الدموية، وهي المواد التي يجب تجنبها. وتكمن الفائدة الهامة هنا في أنه قد يكون من المستحيل تفسير النتائج من حيث التأثيرات المحددة المضادة لتكوين الأوعية الدموية إذا كان هناك تأثير سام قد حدث. وبما أن الجرذان البالغة تنمو بشكل أسرع بكثير من الفئران البالغة، فإن تأثير العوامل السامة على زيادة وزن الجسم يجب أن يكون مؤشراً أكثر حساسية للتأثيرات السامة العامة في الجرذان مقارنة بالفئران.

نود الآن أن نوضح لكم كيفية تحضير عينات النافذة المساريقية. تم قتل هذه الحيوانات باستخدام CO2. يتم فرد النوافذ المساريقية على شرائح زجاجية عادية بمقاس ثلاث بوصات في بوصة واحدة، بدءاً من الجزء القاصي في المساريق.

لا يمكن ملاحظة تكوّن الأوعية الدموية بالعين المجردة في النافذة المساريقية، بدءاً من الصمام اللفائفي الأعور والتحرك في اتجاه تراجعي. تُستخدم النوافذ الأربع التي يتم جمعها من الجزء الأكثر قصاوة من المساريق. وتُجفف العينة الموجودة على الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

يتم قطع جذع الأمعاء. ثم تُحفظ العينات في مجمد عند درجة حرارة 20- °C. وبهذه الطريقة، يمكن حفظ العينات لعدة أشهر، وربما لسنوات، دون حدوث أي تدهور ملحوظ في الجودة.

يتم إجراء الصبغ باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة ضد بطانة الأوعية الدموية في الجرذ، ثم تُترك العينة لتجف في الهواء، ولا يتم تثبيتها باستخدام شريحة غطاء. أما تقدير كمية حالات الأوعية الدموية في النوافذ المساريقية الفردية فيتم باستخدام المجهر المورفومتري بمساعدة الحاسوب، وذلك باستعمال مجهر رسم بتكبير بصري إجمالي يتراوح بين 14 و34. ويتم تصوير النافذة المساريقية بأكملها.

يتم اختيار التكبير في خطوات ثابتة بحيث يتم تغطية أكبر قدر ممكن من مجال الرؤية بالعينات. ويتم تصوير كامل منطقة النافذة بسهولة نظراً لأن الحدود بين النافذة والأنسجة الدهنية المحيطة واضحة. بعد ذلك، يتم رسم جميع الأجزاء الوعائية وفقاً لمعايير محددة بدقة.

يمكن تمييز حتى أصغر الأوعية الدموية التي تكونت حديثاً بوضوح، حيث وُجد أن قطرها عند التكبيرات العالية يتراوح بين 2.5 إلى 3.0 micrometers. وتوضح حقيقة أن متوسط قطر كريات الدم الحمراء في الجرذ يساوي أو أكبر من 6.3 micrometers مدى صغر هذه الأوعية. وتُعرف مساحة جميع الأجزاء الموعاة في النافذة كنسبة مئوية من مساحة النافذة بأكملها باسم مساحة التوعية النسبية va.

إنها، بكل المقاصد والأغراض، قياس للمدى المكاني للأوعية، حيث إن لها امتداداً ثنائي الأبعاد أساساً؛ لذا يمكن قياس VA بسهولة باستخدام القياس عن بُعد بمساعدة الكمبيوتر، على سبيل المثال. تتضمن الخطوة التالية تسجيل كثافة الأوعية الدقيقة وتشكيل النمط ضمن ثلاثة أجزاء مركزية من المناطق الوعائية في كل نافذة. يتم اختيار هذه الأجزاء بشكل منهجي وعشوائي عند تكبير بصري يبلغ 80.

يتم تصوير كل وعاء دموي كخط واحد باستخدام مجهر رسم. تُنقل صورة كل مجال رؤية إلى صورة رقمية ومحلل صور، ثم يتم تقليص سمك كل وعاء في الصورة الرقمية إلى بكسل واحد. بعد ذلك، يقوم الجهاز بقياس عدد البكسلات التي تمثل الأوعية الدموية، ويتم التعبير عنها ككسر من إجمالي البكسلات في مجال الرؤية.

تمثل هذه النسبة المئوية، وهي طول الأوعية الدقيقة أو MVL، طول الأوعية الدقيقة في كل وحدة من المنطقة الوعائية، وهي قياس مركب لكثافة الأوعية الدقيقة. ومن خلال ضرب متوسط المنطقة الوعائية VA لأربع نوافذ لكل حيوان في متوسط MVL لمجموعة العلاج المقابلة، يتم حساب إجمالي طول الأوعية الدقيقة لكل حيوان، وهو TMVL. علاوة على ذلك، قمنا بتطوير تقنيات للتحليل الكمي التفصيلي لكثافة الأوعية الدقيقة وتركيبها باستخدام تحليل الصور.

وتشمل هذه القياسات المسافة الفعلية بين وعاءين دقيقين متتاليين، ونقاط التفرع، وطول الأوعية الدقيقة الفردية، وأطوال القطع LEMS، وعدد الأوعية الدقيقة، والقطع لكل وحدة حجم نسيج NOMS، وعدد نقاط تفرع الأوعية الدقيقة لكل وحدة حجم نسيج NOBP. ويتم تحديد درجة التعرج في الأوعية الدقيقة MVT من خلال الفرق بين أقصر مسافة والمسافة الفعلية بين نقطتي تفرع متتاليتين، وحدوث تقاطع الأوعية الدقيقة، ومؤشر التقاطع INIS، وتكوين الحلقات المترابطة. كما يمكن قياس مؤشر تكوين الحلقات INLF بدقة باستخدام تقنيات مماثلة عند محيط شبكة الأوعية الدقيقة.

يمكننا أيضاً قياس المتغيرات المقابلة للبراعم، بما في ذلك طول البراعم، وLESP، وعدد البراعم لكل وحدة حجم نسيجي، NOSP، مع تصميم التجارب نظراً لاحتمالية وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين الحيوانات في نفس مجموعة العلاج وحتى بين النوافذ المساريقية في الحيوان الواحد نفسه. وقد وجدنا أن التصميم التالي قد يكون عملياً: عدد الحيوانات في كل مجموعة علاجية وقت الملاحظة من 8 إلى 12، وعدد النوافذ لكل حيوان يتم تحليلها من حيث VA، وعدد حقول الرؤية لكل نافذة يتم تحليلها من حيث طول الأوعية الدقيقة، MVL، وطول قطاعات الأوعية الدقيقة، LEMS، وعدد قطاعات الأوعية الدقيقة NOMS، وعدد نقاط تفرع الأوعية الدقيقة، NOBP، وتعرج الأوعية الدقيقة M VT، ومؤشر التقاطع I، ومؤشر تكوين الحلقات INF، مع استخدام ثلاثة حيوانات عولجت بمركبة حاملة كمجموعات ضابطة. ويعد اختبار تولد الأوعية في النافذة المساريقية مناسباً جداً لدراسات تأثير الجرعة ولتحليلات حركية تولد الأوعية.

يمكن القيام بذلك من خلال معالجة مجموعات من الحيوانات بجرعات مختلفة من العامل المحفز لتكوين الأوعية الدموية، ثم التضحية بهذه الحيوانات في نقاط زمنية مختلفة أثناء استجابة تكوين الأوعية. وبهذه الطريقة، يمكن تمييز مرحلة التوسع، والذروة، ومرحلة تراجع تكوين الأوعية اللاحقة من الناحية الكمية. وقد كشفت الدراسات من هذا النوع أن استجابة تكوين الأوعية الدموية الجديدة لأي سيتوكين من عوامل النمو تم اختباره تعتمد تحديداً على الجرعة من حيث السرعة والفاعلية والمدة.

علاوة على ذلك، فإن نمط الأوعية الجديدة من حيث الامتداد المكاني والتغيرات في كثافة الأوعية الدقيقة غالباً ما يكون معتمداً بشكل واضح على الجرعة والوقت مقارنةً بتكوّن الأوعية الدموية بوساطة VEGF أو basic FGF عند جرعات فسيولوجية تقريبية. ويتميز تكوّن الأوعية الدموية بوساطة الخلايا الصارية (MCMA)، والمستحث عبر التنشيط الانتقائي للخلايا الصارية في الموقع، بفعالية أعلى بكثير ومدة أطول بشكل ملحوظ. في الواقع، تم وصف تكوّن الأوعية الدموية بوساطة الخلايا الصارية لأول مرة باستخدام هذا المقاييس نظراً للقدرة على قياس متغيرات تكوّن الأوعية الدموية بموضوعية، والدرجة العالية من الصلة البيولوجية للنظام، وإمكانية التحقق من سمية العلاج.

تعد هذه المنهجية مناسبة بشكل فريد لتحليلات العلاقة بين البنية والنشاط وتحليلات الاستجابة للجرعة. يوفر نموذج MWAA في الجرذان نموذجاً لدراسة تكوّن الأوعية الدموية في نسيج أحشائي وعائي أصلي لدى البالغين يفتقر إلى تكوّن الأوعية الدموية الفسيولوجي ولا يتأثر بالجراحة، مما يستبعد أي تأثير لتكوّن الأوعية الدموية الناجم عن التئام الجروح. إن هذا الاختبار كمي بحق ويقيم بدقة عدداً من المتغيرات الموضوعية ذات الصلة بيولوجياً والتي تصف الامتداد المكاني للأوعية الدقيقة، وكثافتها، وتكوين أنماطها.

يعتبر هذا الفحص مناسباً للغاية لدراسة التأثيرات الجهازية لتكوّن الأوعية الدموية، والعوامل المعدلة لها، وكذلك لدراسات العلاقة بين البنية والنشاط ودراسات الاستجابة للجرعة. تم تطوير المنهجية الموضحة هنا في مختبر الدكتور Kloss Carl Norby في قسم علم الأمراض بمستشفى جامعة Reka، بجامعة Borg في جوتنبرج بالسويد. وقد دعم مجلس البحوث الطبية السويدي، مشروع رقم 5 9 4 2 جميع الدراسات في هذا المشروع.

يتم تقديم الشكر والتقدير للمساعدة الفنية الماهرة للسيدة Gun Effer التي شاركت منذ بداية المشروع، والآنسة Monica Anderson (غير متواجدة)، والسيدة Ann Nemar Lindgren.

آمل أن يكون هذا العرض التقديمي القصير قد أعطاكم فكرة عن إمكانات هذا المقايسة. إذا استخدمتم هذه المقايسة في مختبركم، فسأكون سعيداً بمساعدتكم في حال واجهتم أي مشكلة تقنية. علاوة على ذلك، سأكون ممتناً جداً لأي مقترحات قد تكون لديكم.

شكراً لك.