فحص لفحص الجسيمات النانوية النشطة بيولوجيا لتثبيط إشارات المستقبلات الشبيهة بالحصيلة

خذ صفيحة متعددة الآبار مع بلاعم مراسلة مختلفة تؤوي الفوسفاتيز القلوي الجنيني المفرز ، أو SEAP ، الجين أو جين لوسيفيراز مفرز تحت المحفزات المحفزة.

أضف وسائط تحتوي على أنواع مختلفة من الجسيمات النانوية الببتيد والذهب الممزوجة بعديدات السكاريد الدهنية أو LPS إلى الآبار المحددة.

يرتبط LPS بمستقبلات شبيهة بحصيلة البلاعم ، أو TLR ، مما يؤدي إلى الاستيعاب في الجسيم الداخلي.

تنقل مضخة البروتون الداخلية البروتونات إلى الداخل. يؤدي التحمض إلى إشارات TLR ، مما يؤدي إلى تنشيط عوامل النسخ.

تحفز هذه العوامل على التعبير عن جينات المراسل ، وتنتج SEAP أو luciferase.

بدلا من ذلك ، يؤدي استيعاب LPS جنبا إلى جنب مع الهجينة إلى قيام مجموعات الببتيد سالبة الشحنة بعزل البروتونات اللمعية ، مما يمنع التحمض الداخلي وتثبيط إشارات TLR.

اجمع الوسائط ، وأجهزة الطرد المركزي لفصل المادة الطافية ، وأضف ركائز ل SEAP و luciferase.

SEAP بتحويل ركيزته إلى منتج ملون ، بينما يحفز لوسيفيراز ركيزته لإنتاج اللمعان.

يشير الانخفاض في إشارات المراسل إلى فعالية الهجينة في تثبيط إشارات TLR.

أجهزة الطرد المركزي 20 حجما من محلول الببتيد-GNP الهجين في أنابيب eppendorf سعة 1.5 ملليلتر عند 18,000 مرة جم لمدة 30 دقيقة. تخلص بعناية من المواد الطافية. انقل الهجينة إلى أنبوب واحد طازج ، واغسلها مرتين باستخدام 1 مليلتر من PBS. بعد ذلك ، قم بتعليق الهجينة المغسولة في حجم واحد من وسط R10. امزج كميات متساوية من الهجينة المركزة ووسط R10 المحتوي على LPS بحيث يكون التركيز النهائي للهجينة و LPS 100 مائة نانومولار و 10 نانوغرام لكل مليلتر على التوالي.

بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الثقافة من لوحة زراعة البلاعم. أضف 100 ميكرولتر من خليط LPS الهجين إلى كل بئر مع ثلاث مكررات لكل حالة. قم بتضمين عنصر تحكم سلبي وعنصر تحكم LPS. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، ثم انقل وسط كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي منفصل. الطرد المركزي الأنابيب عند 18,000 مرة جم في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. انقل المواد الطافية إلى طبق سفلي دائري جديد مكون من 96 بئر.

لبدء فحص المراسل على هذه العينات ، أضف 180 ميكرولترا من محلول QUANTI-Blue الدافئ مسبقا إلى كل بئر من صفيحة سفلية مسطحة جديدة مكونة من 96 بئرا ، ثم انقل 20 ميكرولترا من المواد الطافية من كل عينة إلى هذه اللوحة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين حتى يتطور اللون الأزرق الداكن إلى كثافة بصرية تزيد عن 1. بعد ذلك ، استخدم قارئ الألواح لتسجيل الامتصاص عند 655 نانومتر. بعد ذلك ، انقل 10 ميكرولترات من المادة الطافية الطازجة من كل عينة إلى صفيحة بيضاء مسطحة القاع 96 بئرا.

باستخدام حاقن أوتوماتيكي ، أضف 50 ميكرولترا من محلول اللوسيفيراز إلى كل بئر وسجل اللمعان جيدا على الفور. بعد ذلك ، تحقق من التأثير المثبط للمرشحين المحتملين وقم بتقييم خصوصية TLR كما هو موضح في بروتوكول النص.