المناعية : أقسام البارافين باستخدام ABC Vectastain مجموعة من مختبرات المتجهات

مرحبا ، أنا فيكتور تشي وأنا طالب دراسات عليا في مختبر شاندي في قسم علم وظائف الأعضاء والفيزياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا إيرفين. سأوضح اليوم كيفية تلطيخ أقسام البارافين المضمنة باستخدام مجموعة A b و C من Vector Laboratories. يتضمن هذا الإجراء إزالة الشعر بالشمع وترطيب أقسام البارافين المضمنة ، وإجراء استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة لكشف المستضدات ، ومنع البيروكسيديز ، وربط البروتين غير المحدد ، واحتضان القرص المضغوط الرابع وهيدروكسيل التيروزين والأجسام المضادة الثانوية ، وتطوير وتركيب الشريحة.

لذلك دعونا نبدأ. نظرا لأن الشرائح مشفرة بالبارافين ، فإن الخطوة الأولى هي إزالة الشمع من الشرائح. يتم ذلك عادة في غطاء الدخان باستخدام ثلاث عبوات من الزيلين بعد ثلاث غسلات تتكون من خمس دقائق لكل غسلة.

ثم يتم وضع الشرائح في مائة بالمائة من الإيثانول. ستلاحظ أن الشمع الموجود على الشرائح قد اختفى ، لكن احرص على عدم التعامل مع الشرائح بالقفازات لأن الزيلين سيذيب مطاط القفازات. من هناك ، يمكنك حمل الشرائح في الإيثانول بنسبة مائة بالمائة مرة أخرى إلى المختبر حيث ستخضع لتدرج الترطيب.

لذا سأتحدث إليكم هنا عن تدرج الترطيب الذي سيضع شرائحنا من خلالها. يبدأ أولا بحمامين من الإيثانول بنسبة مائة بالمائة. من هناك ، ننقل شرائحنا إلى حمامين يتألفان من 95٪ من الإيثانول.

ثم ننقل شرائحنا إلى حمام واحد يحتوي على 70٪ من الإيثانول ، ومن هناك سننقل شرائحنا إلى حمام يحتوي على 50٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، ننقل شرائحنا إلى 30٪ من الإيثانول ، وبعد دقيقتين سننقل شرائحنا إلى الماء المقطر المزدوج. وعند المعالجة بالماء المقطر المزدوج ، سنترك شريحتنا تجلس في PBS.

لذا سأوضح لكم الآن كيفية حمل الشرائح من حمام إلى آخر في العربات. لذا فإن الخطوة الأولى هي استخدام حامل العربة الخاص بك ، وإزالة الشرائح والكشط برفق لإزالة السوائل الزائدة حتى لا تحمل الكثير من السوائل إلى حمامك التالي. من هناك ، اغمرها وانتظر دقيقتين حتى يتغير التدرج التالي.

في كثير من الأحيان عندما يتم تثبيت الأنسجة، يصبح المستضد مقنعا بحيث لا يمكن للجسم المضاد الارتباط به. لذا ما سأفعله الآن هو أن أريكم طريقة لاسترجاع المستضد الناجم عن الحرارة باستخدام سترات الصوديوم. نحن الآن هنا في الميكروويف حيث سأكشف عن مستضد CD ثمانية ، والذي سأحاول اكتشافه باستخدام الكيمياء المناعية.

وهنا سأضع المحلول الخاص بي وأضعه في الميكروويف لمدة 15 دقيقة. لذلك سنقوم بغلي سترات الصوديوم مع الشرائح لمدة 15 دقيقة للتأكد من عدم جفاف شرائحنا. سنراقب شرائحنا حتى نعيد ملئها بسترات الصوديوم عند الغليان للتأكد من بقاء الشرائح رطبة.

لذا قبل أن أضع الشرائح الخاصة بي في سترات الصوديوم ، قمت بالفعل بتسخين المحلول الخاص بي لمدة 45 ثانية. ثم وضعت شرائحي في سترات الصوديوم ، والآن أقوم بتسخين سترات الصوديوم لمدة 15 دقيقة. مع وجود الشرائح فيه ، عادة ما يبدأ المحلول في الغليان في حوالي دقيقتين إلى دقيقتين ونصف في عملية الغليان.

عند هذه النقطة ، سأتوقف وأستبدل سترات الصوديوم المفقودة بسترات الصوديوم الطازجة. بعد غلي سترات الصوديوم لمدة 15 دقيقة ، نريد إزالة الشرائح والمحلول وتبريدها. وبالتالي فإن أفضل طريقة للقيام بذلك هي تغطية حامل الشريحة ، وسكب السائل الزائد ، وتشغيله على تيار من الماء البارد حتى يبرد المحلول الموجود داخل البرطمان إلى درجة حرارة الغرفة.

وهذا عادة ما يستغرق حوالي 10 إلى 15 دقيقة. لذلك بعد إزالة الشرائح من الحوض ، نحتاج إلى منع نشاط البيروكسيديز الداخلي في الأنسجة. إذن، ما سنفعله هو صنع محلول بيروكسيد الهيدروجين باستخدام 30٪ من بيروكسيد الهيدروجين وتكوين محلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 1٪.

ومن هنا، أقوم فقط بنقل الشرائح مباشرة إلى محلول بيروكسيد الهيدروجين. والآن سنحضن الشرائح في بيروكسيد الهيدروجين لمدة 20 دقيقة. الآن ، بعد مرور 20 دقيقة ، بعد منع البيروكسيديز الداخلي ، سأقوم الآن بغسل بيروكسيد الهيدروجين من الشرائح باستخدام غسلات PBS.

لذلك سأقوم بنقل الشرائح الخاصة بي إلى العربة وغسلها بثلاث غسلات تتكون من خمس دقائق لكل منها. لذلك تم وضع هذه الشرائح من الخلف إلى الخلف لتجنب ملامسة الشرائح الأخرى التي قد تلحق الضرر بالأنسجة. لذلك أنا فقط أنزلق من الشرائح وأقوم بترتيب الشرائح بحيث لا يكون للأنسجة إمكانية ملامسة الزجاج.

هناك ننقل شرائحنا إلى PBS. لذلك بعد غسل شرائحنا باستخدام PBS ، سأقوم الآن بحظر الشرائح من أجل الارتباط غير المحدد للبروتينات بمحلول 5٪ BSA و 5٪ مصل الماعز و 0.1٪ أزيد الصوديوم. لذلك تريد تغيير مصل الماعز إلى نوع آخر إذا كنت تعمل مع الأجسام المضادة للماعز.

لذا في الوقت الحالي ، سأضع الشرائح في حامل الشرائح الخاص بنا وأملأها بالحل الخاص بنا. لذلك عادة ما أقوم بملئه في منتصف الطريق بحيث يتأكد حجم الشرائح من غمر الأنسجة. لذا فإن الشيء الوحيد الذي تريد التأكد منه عند وضع الشرائح في الحاوية هو تجنب ملامسة هذه الأنسجة لجوانب الحاوية.

لذلك بالنسبة للشريحة الأخيرة ، قم بتدويرها للداخل حتى لا تلمس الأنسجة الحاوية. والآن بعد أن قمت بحظر الشرائح الخاصة بي بين عشية وضحاها ، سأغسل محلول الحجب الزائد بثلاث غسلات من خمس ، تتكون من خمس دقائق في PBS. لذلك في هذه المرحلة، نريد رسم دائرة باستخدام مانع السوائل حول أنسجتنا حتى نتمكن من تقليل كمية الجسم المضاد المستخدم.

إذا لم تكن قلقا بشأن الحفاظ على الأجسام المضادة ، فيمكنك دائما احتضان الشرائح في نفس الأغلفة التي قمنا بخطوة الحظر فيها. من هذه النقطة فصاعدا ، سأوضح لكم كيف نرسم باستخدام مانع السوائل حول أنسجتنا. لذلك أولا نزيل الدم من السائل الزائد ، مع الحرص على عدم لمس الأنسجة.

لذلك فقط امسح الزوايا لإزالة السوائل الزائدة. مرة أخرى ، أن تكون حريصا جدا جدا على عدم لمس الأنسجة. خذ دبوس حجب السائل ، واضغط لأسفل برفق للحصول على التدفق ، ومن هناك ، قم بتطويق الأنسجة بقلمك.

اترك مانع السوائل يجف لمدة 15 ثانية تقريبا. في هذه المرحلة ، نريد إضافة الجسم المضاد الأساسي. وهكذا باستخدام ماصة ، تأكد من تغطية الأنسجة بالجسم المضاد الأساسي ونقلها إلى الصندوق الذي يتم التحكم فيه بالرطوبة.

لذلك نستخدم مناديل كيم. تزوج مع بعض الماء في هذا الصندوق لمنع الشريحة من الجفاف لأنها تحتضن الجسم المضاد الأساسي. الآن بعد أن تم احتضان الجسم المضاد الأساسي لمدة ساعة ، سنقوم بإزالة الشرائح الخاصة بنا وغسل الجسم المضاد الزائد باستخدام PBS.

لذا مرة أخرى ، فقط اترك السائل يجف وأدخله في غسول PBS. ومرة أخرى ، اغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق. لذلك بعد ثلاث غسلات مدتها خمس دقائق ، سنضيف جسمنا المضاد الثانوي إلى أنسجتنا بنفس الطريقة التي أضفنا بها الجسم المضاد الأساسي.

لذا مجرد استخدام حجم كاف لتغطية أنسجتك ، أضف الجسم المضاد الثانوي ، الذي نستخدمه هو مضاد للأرانب الماعز ، وانقل شريحتك مرة أخرى إلى غرفة التحكم في الرطوبة. ولذا فإننا نستخدم جسما مضادا ثانويا ، وهو مضاد للأرانب البيوتينيل ، وهو أمر ضروري عند استخدام طريقة A BC. لذلك نقوم بنقل الشريحة الخاصة بنا إلى الغرفة التي يتم التحكم فيها بالرطوبة ونسمح لها بالتحتضن لواحد للخارج.

لذا، أثناء احتضان الجسم المضاد الثانوي، نحتاج إلى تحضير الكاشف A BC. إذن، نحن نستخدم مختبرات النواقل، الكاشف A وB وC من مجموعة البقع المتجهة. لذا قم بإزالة الكاشف ، واتركه يسقط ثلاث مرات في 15 مل من PBS مع الحرص على عدم الضغط على الأنبوب لأن القطرات يجب أن تكون مقاسة على وجه التحديد وبحجم معين.

لذلك بعد الانتهاء من احتضان الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة تقريبا ، تأخذ الشرائح الخاصة بك وتضعها ، وتغسلها مرة أخرى في PBS ، تماما كما فعلت مع الجسم المضاد الأساسي. لذلك بعد ثلاث غسلات تتكون من خمس دقائق لكل منها ، تقوم بعد ذلك بنقل الشرائح إلى هذه الحاوية حيث تضيف الكاشف A B و C ، الذي أعددته قبل 30 إلى 45 دقيقة من الموعد المحدد. ولذا يمكنك فقط إضافة كاشف A و B و C هنا وملء الشرائح الخاصة بك والسماح لها بالاحتضان لمدة 30 إلى 45 دقيقة أخرى.

لذلك بعد أن تجلس الشرائح في A و B و C لمدة 34 إلى خمس دقائق ، نريد غسل محلول A و B و C الزائد. لذلك ما عليك سوى إزالة الشرائح الخاصة بك وإضافتها إلى حل PBS الخاص بك. ولذا نريد تكرار نفس إجراء الغسيل ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

أثناء غسل الشرائح ، أقوم بإعداد ركيزة بيروكسيداز DAB من مختبرات النواقل. آخذ المخزن المؤقت لدرجة الحموضة 7.5 وأضيف قطرتين. بعد المخزن المؤقت لدرجة الحموضة 7.5 ، آخذ كاشف تفاعل الركيزة DAB ، وأضيف قطرتين من ذلك.

مرة أخرى ، حجم القطرة أمر بالغ الأهمية ، لذلك لا تضغط على الزجاجة واترك القطرات تسقط. قطرتان لدرجة الحموضة المخزن المؤقت 7.5. لذلك تريد إضافة أربع قطرات من كاشف الركيزة DAB ، مما يسمح له بالسقوط أيضا.

تريد أيضا أن تضيف في النهاية ، تريد إضافة قطرتين من كاشف ركيزة بيروكسيد الهيدروجين. إذن هذه هي الطريقة التي يجب أن يبدو بها خليط كاشف الركيزة DAB. الآن أصبح جاهزا للإضافة إلى الشرائح وإزالة الشرائح والسماح ل PBS بتصريف الشرائح.

لذلك بمرور الوقت ، يصبح كاشف DAB أكثر بنيا. لذلك نريد إضافته إلى الشرائح في هذه المرحلة. لذا خذ حجما كافيا لتغطية الأنسجة وأضفها مباشرة إلى عينات الأنسجة.

لذا ما عليك سوى أخذ الحجم المناسب وإضافته مباشرة فوق عينات الأنسجة الخاصة بك ، والسماح للمحلول بالتطور حيث يجب أن تصبح عينات الأنسجة أكثر بنية اللون بعد مرور الوقت. بعد إضافة محلول DAB الخاص بك ، يمكنك أن ترى في قسم الدماغ هذا حيث يتحول لون الأنسجة إلى اللون البني هنا وهنا. يكشف DAB البني عن المنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية الدوبامين في الدماغ المتوسط.

بعد تطوير الشرائح الخاصة بك من أي مكان من دقيقتين إلى 10 دقائق ، تريد إضافة الشرائح الخاصة بك ، لذلك تريد إضافة الشرائح إلى الماء المثلج لإيقاف التفاعل. لذا فقط اترك المحلول يجف وأضف الشرائح مباشرة إلى الماء المثلج. بعد غمر الشرائح في الماء المثلج ، خذ حمامك إلى الحوض وقم بتشغيل الماء البارد فيه لمدة خمس دقائق تقريبا للتأكد من أن كل محلول DAB يتم تصريفه من هذا الحمام.

لذلك عند إضافة الحوض ، كن حذرا حتى لا تدع التيار يصطدم بالأنسجة وجعله يصطدم بإحدى الزوايا ويسمح له بالتفيض حتى لا تنزعج أنسجتك من تدفق المياه. لذلك بعد إزالة الشرائح من الغسيل ، تريد عمل وصمة عار مضادة. فلماذا قد ترغب في وصمة عار مضادة؟

حسنا ، أحد الأسباب هو أنك قد ترغب في رؤية بنية أنسجتك. آخر هو تصور جميع الخلايا. لأغراضنا، سنتصدى للبقع باستخدام الهيمات توين، التي تعني النوى.

لذلك نريد فقط أن نأخذ شرائحنا ، ونزيل السوائل الزائدة ، ونغمسها مرة واحدة في محلول هيماتين هيماتين. أولا ، أخرجه وأضفه مباشرة إلى الماء. بعد إضافة الشرائح الخاصة بك في ماء الصنبور ، تريد أن تأخذ الشرائح الخاصة بك وتديرها تحت الماء ، تماما كما فعلت سابقا مع حمام الماء المثلج.

لذلك بالنسبة لغسل hemat Toin ، فقط اتركه يعمل تحت الماء الجاري حتى يصبح الماء داخل البرطمان صافيا. لذلك بعد إزالة الشرائح الملطخة المضادة من الماء ، نريد إعادة تجفيف شرائحنا. ولذا نريد إعادته من خلال تدرج الإيثانول ، ولكن بترتيب عكسي.

لذلك سيكون ذلك غسلة واحدة بالماء منزوع الأيونات ، وغسلة واحدة ب 30٪ من الإيثانول ، وغسل واحد بنسبة 50٪ من الإيثانول ، وغسلتان ، و 95٪ إيثانول ، وغسلتان ، و 100٪ إيثانول يتكون كل منهما دقيقتان. لذا قم بإزالة الشرائح الخاصة بك ، وامسح السائل الزائد وأضفه مباشرة إلى الإيثانول بنسبة 30٪ ، واتركه لمدة دقيقتين. لذا بعد آخر غسيل إيثانول بنسبة مائة بالمائة ، نريد إعادة الشرائح إلى الزيلين.

لذا خذ الشرائح مرة أخرى ، وكشط السائل الزائد ، وخذ الشرائح وأضفها إلى الزيلين الأول لمدة خمس دقائق. لذلك ستكون هذه ثلاث غسلات متتالية من الزيلين لمدة خمس دقائق لكل منها. والآن نحن مستعدون لتركيب شرائحنا.

لذا فإن ما أفعله عادة هو قبل دقيقة واحدة من جاهزية الشرائح ، آخذ ماصة المراعي الخاصة بي وأرسم محلول تثبيت التجعيد ، وأسمح لذلك بالذهاب لمدة دقيقة تقريبا قبل أن تصبح شرائحي جاهزة للخروج بعد آخر غسل للزيلين ، مع الحرص على عدم غمر القفازات أو تبلل قفازاتك بالزيلين ، قم بإزالتها باستخدام زوج من الملقط ، مع الحرص على الجانب الذي يحتوي على الأنسجة. امسح فائض XLE برفق بمنديل Kim ، مع الحرص على عدم لمس المنديل ، فقط امسح بعناية من الزوايا والحواف ، مما يسمح لمعظم الزيلين بالتبخر. يمكنك على الأرجح العمل على شريحتين قبل أن تجف إحداهما.

لذلك عندما تنتهي من تجفيف شريحة واحدة ، يجب أن تكون الشريحة الأخرى جاهزة للعمل معها. الآن عليك العمل معهم قبل أن يجفوا تماما. لذلك تريد أن تأخذ perimount الخاص بك وترسم خطا رفيعا بجوار منديلك ، مع الحرص على عدم لمس أنسجتك.

قم بإزالة المحيط مع أخذ زلة الغطاء. ضعه بزاوية 45 درجة واتركه ينحني. ثم حرك قسيمة الغطاء الخاصة بك ، وتأكد من أن المحيط يغطي جميع الأنسجة.

ثم ضعه وضعه واضغط برفق في المنتصف لإزالة جميع فقاعات الهواء الزائدة. اتركه حتى يجف أثناء العمل على الأنسجة الثانية هو الوقت المناسب لإلقاء نظرة على شرائحنا ، وليس في الواقع. لذلك نحتاج إلى السماح لحامل perma بالجفاف طوال الليل قبل النظر إلى شرائحنا.

خلاف ذلك ، تحت ضوء المجهر ، سوف ينفجر حامل بيرما ، وبعد ذلك ستدمر عينتك. فيما يلي نظرة على أقسام الدماغ لدينا بعد تلطيخها بالمواد الكيميائية ، والأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب الموجهة ضد هيدروكسيلاز التيروزين. مرة أخرى ، تظهر وصمة عار DAB البنية موقع الخلايا العصبية الدوبامين في الدماغ المتوسط.

بقعة الهيماتين المضادة كل النوى في هذا النسيج إلى اللون الأزرق. لقد أوضحت لك للتو كيفية تلطيخ أقسام البارافين المضمنة باستخدام مجموعة A BC من Vector Laboratories. ستحتاج الآن إلى ضبط الظروف وفقا لأنواع الأنسجة التي ستلطخها والأجسام المضادة التي ستستخدمها.

حظا سعيدا في تجاربك.