المناعية : أقسام البارافين باستخدام ABC Vectastain مجموعة من مختبرات المتجهات

مرحباً، أنا فيكتور تشي، طالب دراسات عليا في مختبر تشاندي بقسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية في جامعة كاليفورنيا إيرفاين. سأقوم اليوم بشرح كيفية صبغ المقاطع المضمنة في البارافين باستخدام مجموعة A b, C من مختبرات Vector Laboratories. تتضمن هذه العملية إزالة الشمع وترطيب المقاطع المضمنة في البارافين، وإجراء استعادة المستضدات المستحثة حرارياً للكشف عن المستضدات، وحجب البيروكسيديز والارتباط البروتيني غير النوعي، ثم التحضين باستخدام CD four والـ tyrosine hydroxylase والأجسام المضادة الثانوية، وأخيراً تطوير الشريحة وتثبيتها.

فلنبدأ الآن. نظرًا لأن الشرائح محفوظة في البرافين، فإن الخطوة الأولى هي إزالة الشمع من الشرائح. يتم ذلك عادةً في خزانة استخلاص الأدخنة باستخدام ثلاث جارات من xylene بعد ثلاث غسلات تستغرق كل غسلة منها خمس دقائق.

توضع الشرائح بعد ذلك في إيثانول بنسبة 100%. ستلاحظ اختفاء الشمع من على الشرائح، ولكن احذر من التعامل مع الشرائح باستخدام القفازات لأن الزيلين سيؤدي إلى إذابة مطاط القفازات. ومن ثم، يتم نقل الشرائح الموجودة في الإيثانول بنسبة 100% مرة أخرى إلى المختبر حيث ستخضع لتدرج ترطيب.

سأتحدث هنا عن تدرج الترطيب الذي سنمرر من خلاله الشرائح. يبدأ الأمر أولاً بحمامين من ethanol بتركيز 100%. ومن هناك، ننقل الشرائح إلى حمامين يتكونان من 95% ethanol.

بعد ذلك، ننقل الشرائح إلى حمام من الإيثانول بتركيز 70%، ومن هناك ننقلها إلى حمام من الإيثانول بتركيز 50%. بعد ذلك، ننقل الشرائح إلى إيثانول بتركيز 30%، وبعد دقيقتين ننقلها إلى ماء مقطر مزدوج. وعقب المعالجة بالماء المقطر المزدوج، نترك الشرائح في محلول PBS.

سأوضح لكم الآن كيفية نقل الشرائح من حمام إلى آخر باستخدام الحوامل. تتمثل الخطوة الأولى في استخدام حامل الشرائح لإخراجها، ثم كشطها بلطف لإزالة السائل الزائد لضمان عدم نقل كمية كبيرة من السائل إلى الحمام التالي. بعد ذلك، اغمرها في الحمام وانتظر دقيقتين حتى موعد تغيير التدرج التالي.

في كثير من الأحيان عند تثبيت الأنسجة، يصبح المستضد محجوباً بحيث لا يستطيع الجسم المضاد الارتباط به. لذا، سأعرض لكم الآن طريقة لاستعادة المستضد المستحثة حرارياً باستخدام سترات الصوديوم. نحن الآن أمام الميكروويف حيث سأقوم بإزالة حجب مستضد CD eight، والذي سأحاول الكشف عنه باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية.

وسأقوم الآن بوضع المحلول في الميكروويف وتسخينه لمدة 15 دقيقة. وبذلك سنغلي سترات الصوديوم مع الشرائح لمدة 15 دقيقة لضمان عدم جفاف الشرائح. سنراقب الشرائح بحيث نقوم بإعادة ملء سترات الصوديوم عند حدوث الغليان لضمان بقاء الشرائح رطبة.

لذا، قبل وضع الشرائح في سترات الصوديوم، قمت بتسخين المحلول مسبقاً لمدة 45 ثانية. بعد ذلك، وضعت الشرائح في سترات الصوديوم، وأقوم الآن بتسخين سترات الصوديوم لمدة 15 دقيقة. ومع وجود الشرائح بداخلها، يبدأ المحلول عادةً في الغليان والفيضان بعد مرور دقيقتين إلى دقيقتين ونصف تقريباً من بدء عملية الغليان.

عند هذه النقطة، سأتوقف وأستبدل سترات الصوديوم المفقودة بسترات صوديوم جديدة. بعد غلي سترات الصوديوم لمدة 15 دقيقة، نريد إخراج الشرائح والمحلول وتبريدهما. وأفضل طريقة للقيام بذلك هي إغلاق حامل الشرائح، وسكب السائل الزائد، ثم تمرير الحامل تحت تيار من الماء البارد حتى يبرد المحلول داخل الوعاء ليصل إلى درجة حرارة الغرفة.

وعادةً ما تستغرق هذه العملية من 10 إلى 15 دقيقة. لذا، بعد إخراج الشرائح من الحوض، نحتاج إلى تثبيط نشاط البيروكسيديز الداخلي في الأنسجة. وللقيام بذلك، سنقوم بتحضير محلول من بيروكسيد الهيدروجين باستخدام بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 30% لإعداد محلول بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 1%.

ومن هنا، أقوم بنقل الشرائح مباشرة إلى محلول بيروكسيد الهيدروجين. والآن سنقوم بحضن الشرائح في بيروكسيد الهيدروجين لمدة 20 دقيقة. والآن، بعد مرور 20 دقيقة، وبعد حجب البيروكسيداز الداخلي، سأقوم بغسل بيروكسيد الهيدروجين من على الشرائح باستخدام غسلات من PBS.

سأقوم بنقل الشرائح إلى الحامل وغسلها ثلاث مرات، بحيث تستغرق كل عملية غسل خمس دقائق. لقد وُضعت هذه الشرائح ظهراً لظهر لتجنب ملامستها للشرائح الأخرى التي قد تتسبب في تلف النسيج. لذا، سأكتفي بسحب الشرائح وترتيبها بحيث لا يكون هناك أي احتمال لملامسة النسيج للزجاج.

نقوم الآن بنقل الشرائح إلى محلول PBS. لذا، بعد غسل الشرائح بمحلول PBS، سأقوم بحجب الشرائح لمنع الارتباط غير النوعي للبروتينات باستخدام محلول يتكون من 5%BSA و5%goat serum و0.1%sodium azide. ويجب تغيير الـ goat serum إلى نوع آخر من المصل إذا كنت تعمل باستخدام أجسام مضادة مشتقة من الماعز.

سأقوم الآن بوضع الشرائح في حامل الشرائح وملئه بالمحلول الخاص بنا. عادةً ما أملأ الحامل حتى المنتصف فقط، بحيث يضمن حجم الشرائح غمر الأنسجة بالكامل. ومن الأمور التي يجب التأكد منها عند وضع الشرائح في الحاوية هي تجنب ملامسة هذه الأنسجة لجوانب الحاوية.

بالنسبة للشريحة الأخيرة، قم بتدويرها نحو الداخل بحيث لا يلامس النسيج الحاوية. والآن، بعدما قمت بحجب الشرائح طوال الليل، سأغسل محلول الحجب الزائد من خلال ثلاث غسلات، تتكون كل منها من خمس دقائق في PBS. في هذه المرحلة، نريد رسم دائرة باستخدام حاجب سائل حول النسيج لتقليل كمية الأجسام المضادة المستخدمة.

إذا كنت لا تهتم بتوفير الأجسام المضادة، فيمكنك دائمًا تحضين الشرائح في نفس الحافظات التي استخدمتها في خطوة الحجب. لذا، ومن هذه النقطة فصاعدًا، سأوضح لكم كيفية الرسم بالمادة الحاجبة السائلة حول النسيج. أولاً، نقوم بإزالة السائل الزائد، مع الحرص على عدم لمس النسيج.

لذا، قم بالمسح حول الزوايا لإزالة السائل الزائد. ومرة أخرى، كن حذراً للغاية لتجنب لمس النسيج. خذ دبوس سد السائل، واضغط لأسفل برفق لبدء التدفق، ومن ثم، أحط النسيج بالقلم.

اترك السدادة السائلة لتجف لمدة 15 ثانية تقريبًا. في هذه المرحلة، نريد إضافة الجسم المضاد الأولي. وباستخدام الماصة، تأكد من تغطية النسيج بالجسم المضاد الأولي، ثم انقله إلى صندوق التحكم في الرطوبة.

لذلك نستخدم منديلاً من نوع Kim wipe، مبللاً ببعض الماء منزوع الأيونات (di water) في هذه العلبة لمنع جفاف الشريحة أثناء تحضينها مع الجسم المضاد الأولي. والآن، وبعد أن تم تحضين الجسم المضاد الأولي لمدة ساعة، سنقوم بإزالة الشرائح وغسل الجسم المضاد الزائد باستخدام محلول PBS.

لذا، مرة أخرى، اترك السائل يتصرف ثم ضع العينة في محلول غسيل PBS. وكرر عملية الغسيل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. وبعد إتمام عمليات الغسيل الثلاث التي تستغرق كل منها خمس دقائق، سنضيف الجسم المضاد الثانوي إلى النسيج بنفس الطريقة التي أضفنا بها الجسم المضاد الأولي.

باستخدام حجم كافٍ من المحلول لتغطية الأنسجة، أضف الجسم المضاد الثانوي، والذي نستخدم هنا الجسم المضاد من الماعز ضد الأرنب (goat anti rabbit)، ثم أعِد الشريحة إلى غرفة التحكم في الرطوبة. إننا نستخدم جسماً مضاداً ثانوياً، وهو جسم مضاد من الماعز ضد الأرنب مبيوتناً (biotinylated goat anti rabbit)، وهو أمر ضروري عند استخدام طريقة ABC. لذا، ننقل الشريحة إلى غرفة التحكم في الرطوبة ونتركها لتحضن لمدة ساعة واحدة.

بينما يتم تحضين الجسم المضاد الثانوي، نحتاج إلى تحضير كاشف ABC. لذا، سنستخدم كاشف ABC من شركة Vector Laboratories، والموجود في مجموعة Vector stain. قم بإزالة الكاشف a وقم بتحضيره، ثم اسمح بنزول ثلاث قطرات منه في 15 milliliters من PBS، مع توخي الحذر من الضغط على الأنبوب لأن القطرات يجب أن تكون مدرجة بدقة وبحجم محدد.

بعد تحضين الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة تقريبًا، خذ الشرائح واغسلها مرة أخرى في محلول PBS، تمامًا كما فعلت مع الأجسام المضادة الأولية. لذا، بعد ثلاث غسلات تستغرق كل منها خمس دقائق، انقل الشرائح إلى هذه الحاوية حيث تضيف كاشف A B, C الذي قمت بتحضيره مسبقًا قبل 30 إلى 45 دقيقة. قم ببساطة بإضافة كاشف A, B, C هنا وتغطية الشرائح به، واتركها لتتحضن لمدة 30 إلى 45 دقيقة أخرى.

بعد ترك الشرائح في محلول A, B, C لمدة تتراوح بين 3 إلى 5 دقائق، نحتاج إلى غسل محلول A, B, C الزائد. لذا، قم بإزالة الشرائح ووضعها في محلول PBS. ونريد تكرار إجراء الغسيل نفسه ثلاث مرات في محلول PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

أثناء غسل الشرائح، أقوم بتحضير ركيزة DAB لإنزيم البيروكسيديز من شركة Vector Laboratories. آخذ محلول منظم بـ pH 7.5 وأضيف منه قطرتين. بعد إضافة محلول منظم pH 7.5، آخذ كاشف تفاعل ركيزة DAB وأضيف منه قطرتين.

مرة أخرى، يُعد حجم القطرة أمراً بالغ الأهمية، لذا لا تضغط على الزجاجة واكتفِ بترك القطرات تسقط. قطرتان للمحلول المنظم pH 7.5. بعد ذلك، يتعين عليك إضافة أربع قطرات من كاشف مادة DAB الأساس، مع تركها تسقط أيضاً.

تريد أيضاً أن تضيف في النهاية قطرتين من كاشف مادة الـ hydrogen peroxide الأساسية. هكذا يجب أن يبدو مزيج كاشف مادة الـ DAB الأساسية. الآن أصبح المزيج جاهزاً للإضافة إلى الشرائح؛ أخرج شرائحك، واترك محلول الـ PBS يتصرف ببساطة من عليها.

وبمرور الوقت، يصبح كاشف DAB أكثر بنياً. لذا، نريد إضافته إلى الشرائح في هذه المرحلة. لذا، خذ حجماً كافياً لتغطية الأنسجة وأضفه مباشرة فوق عينات الأنسجة.

لذا، قم فقط بأخذ الحجم المناسب وإضافته مباشرة فوق عينات الأنسجة، واترك المحلول يتفاعل حيث يجب أن يصبح لون عينات الأنسجة أكثر بنياً بمرور الوقت. بعد إضافة محلول DAB، يمكنك أن ترى في هذا المقطع العرضي للدماغ كيف يتحول لون النسيج إلى البني هنا وهنا. ويكشف تلوين DAB البني عن المنطقة التي تحتوي على العصبونات الدوبامينية في الدماغ المتوسط.

بعد تحميض الشرائح لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى 10 دقائق، يجب وضع الشرائح في ماء مثلج لإيقاف التفاعل. لذا، اترك المحلول يتصفى ثم ضع الشرائح مباشرة في الماء المثلج. بعد غمر الشرائح في الماء المثلج، انقل الحمام إلى الحوض واجعله تحت تيار من الماء البارد لمدة خمس دقائق تقريبًا للتأكد من تصريف جميع محلول DAB من هذا الحمام.

لذا عند الإضافة في الحوض، كن حذراً لكي لا يصطدم تيار الماء بالنسيج، بل اجعله يصطدم بأحد الزوايا واتركه يفيض ببساطة حتى لا تتعرض الأنسجة للاضطراب بسبب تدفق تيار الماء. لذا بعد إزالة الشرائح من عملية الغسل، ستحتاج إلى إجراء صبغ تبايني. فما السبب الذي قد يجعلك ترغب في استخدام الصبغ التبايني؟

حسنًا، أحد الأسباب هو أنك قد ترغب في رؤية بنية نسيجك. وسبب آخر هو تصور جميع الخلايا. لذا، ولأغراضنا، سنقوم بإجراء صبغ تبايني باستخدام hemat toin، والذي يشير إلى النوى.

لذلك، نريد فقط أخذ الشرائح، وإزالة السائل الزائد، ثم غمسها لمرة واحدة في محلول Hemat Hematin. ثم نخرجها ونضعها مباشرة في الماء. بعد وضع الشرائح في ماء الصنبور، يجب عليك أخذ الشرائح وشطفها تحت الماء، تماماً كما فعلت سابقاً مع حمام الماء المثلج.

بالنسبة لغسيل صبغة الهيماتوكسيلين، ما عليك سوى ترك الشرائح تحت الماء الجاري حتى يصبح الماء داخل الوعاء رائقاً. وبعد إخراج الشرائح المصبوغة بالصبغة المتباينة من الماء، نريد إعادة تجفيف الشرائح. ولذلك، سنقوم بتمريرها مجدداً عبر تدرج الإيثانول، ولكن بترتيب عكسي.

وبالتالي تكون العملية عبارة عن غسلة واحدة بالماء منزوع الأيونات، وغسلة واحدة بـ 30% ethanol، وغسلة واحدة بـ 50% ethanol، وغسلة واحدة بـ 70% ethanol، ثم غسلتين بـ 95% ethanol، وغسلتين بـ 100% ethanol، بحيث تستغرق كل غسلة دقيقتين. لذا، قم بإخراج الشرائح ومسح السائل الزائد، ثم ضعها مباشرة في 30% ethanol، واتركها لمدة دقيقتين. وبعد الغسلة الأخيرة بـ 100% ethanol، نريد إعادة الشرائح إلى xylene.

قم بأخذ الشرائح مرة أخرى، مع كشط السائل الزائد، ثم ضع الشرائح في حمام الزايلين الأول لمدة خمس دقائق. وبذلك تكون قد أجريت ثلاث غسلات متتالية بالزايلين لمدة خمس دقائق لكل منها. والآن أصبحنا مستعدين لتثبيت شرائحنا.

ما أفعله عادةً هو أنه قبل دقيقة واحدة من جاهزية الشرائح، أستخدم ماصة باستور لسحب محلول التثبيت الدائم (perm mount solution)، وأتركه لمدة دقيقة تقريباً قبل أن تكون الشرائح جاهزة للإخراج. بعد الغسلة الأخيرة من الزايلين (xylene)، ومع الحرص على عدم غمر القفازات أو بللها بالزايلين، قم بإزالة الشرائح باستخدام ملقط مع الانتباه إلى الجانب الذي يحتوي على النسيج. امسح الزايلين الزائد بلطف باستخدام منديل Kim wipe، مع الحرص على عدم لمس النسيج، بل امسح الزوايا والحواف بعناية، مما يسمح لمعظم الزايلين بالتبخر. يمكنك على الأرجح العمل على شريحتين قبل أن تجف إحداهما.

بمجرد انتهائك من تجفيف شريحة واحدة، من المفترض أن تكون الشريحة الأخرى جاهزة للعمل عليها. الآن يجب عليك التعامل معهما قبل أن يجفا تماماً. لذا، قم بأخذ مادة الـ perimount ورسم خط رفيع بجانب النسيج، مع الحرص على عدم لمس النسيج.

أزل مادة التثبيت (perimount) مع أخذ شريحة التغطية. ضعها بزاوية 45 درجة واتركها تنخفض تدريجياً. ثم قم بتمرير شريحة التغطية، مع التأكد من أن مادة التثبيت تغطي جميع الأنسجة.

بعد ذلك، قم بوضعها ثم اضغط برفق في المركز لإزالة جميع فقاعات الهواء الزائدة. اتركها لتجف بينما تعمل على النسيج الثاني؛ وبالنسبة لوقت فحص الشرائح، فليس الآن، إذ نحتاج إلى ترك مادة perma mount تجف طوال الليل قبل فحص الشرائح.

خلاف ذلك، وتحت ضوء المجهر، ستتكون فقاعات في مادة التثبيت الدائم (perma mount)، مما سيؤدي إلى إتلاف العينة. إليكم نظرة على مقاطع الدماغ بعد صبغها بالمواد الكيميائية، وبواسطة جسم مضاد متعدد النسائل من الأرانب موجه ضد tyrosine hydroxylase. ومرة أخرى، يوضح صبغ DAB البني موقع العصبونات الدوبامينية في الدماغ المتوسط.

تؤدي صبغة الهيماتين المتباينة إلى تلوين جميع النوى في هذه الأنسجة باللون الأزرق. وبذلك، أكون قد أوضحت لكم كيفية صبغ المقاطع المدمجة في البارافين باستخدام مجموعة ABC من مختبرات Vector Laboratories. والآن، ستحتاجون إلى ضبط الظروف وفقاً لأنواع الأنسجة التي ستقومون بصبغها والأجسام المضادة التي ستستخدمونها.

لذا، نتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.