تقييم فعالية مركب الاختبار المضاد للفيروسات من خلال فحص التعطيل الفيروسي

خذ أنابيب تحتوي على فيروس التهاب الكبد C المؤتلف ، أو تعليق التهاب الكبد C الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي الذي يشفر مراسل لوسيفيراز مفرز.

أضف مركب اختبار مضاد للفيروسات ومذيب إلى أنابيب الاختبار والتحكم السلبي.

ترتبط مركبات الاختبار بالبروتينات السكرية لفيروس التهاب الكبد C ، مما يؤدي إلى تعطيل الفيروس.

بعد الحضانة ، قم بتخفيف الخلائط لمنع تفاعلات الخلايا المركبة في الخطوات اللاحقة.

أضف هذه الخلطات المخففة إلى الطبقات الأحادية الورمية الكبدية الداعمة لتكاثر فيروس التهاب الكبد C. حضن.

لا يمكن أن يرتبط فيروس التهاب الكبد C المعطل بمستقبلات معينة من سطح الخلية ، بينما ترتبط البروتينات السكرية النشطة لفيروس التهاب الكبد C بهذه المستقبلات ، مما يسهل الارتباط الخلوي.

قم بإزالة HCVs غير الممتزة. يغسل بمخزن مؤقت ويضاف الوسائط. احتضان لفترة طويلة.

يتم استيعاب فيروس التهاب الكبد C المرتبط ، وإطلاق الحمض النووي الريبي الفيروسي ويؤدي إلى تخليق البروتين الفيروسي واللوسيفيراز ، الذي يفرز من الخلية.

اجمع المواد الطافية المحتوية على لوسيفيراز. الطرد المركزي وإضافة ركيزة لوسيفيراز إلى المواد الطافية

يؤكسد لوسيفيراز الركيزة ، وينبعث منه الضوء.

التلألؤ العالي في بئر التحكم مقارنة بالاختبار إلى تعطيل الفيروس بواسطة المركب.

لبدء مقايسة التعطيل الفيروسي ، أولا ، قم أولا بوضع اللوحة 1 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر في صفيحة مكونة من 96 بئرا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل للتعلق. للعدوى، قم بإعداد فيروس التهاب الكبد C أو جزيئات التهاب الكبد C الموسومة من قبل مراسل Gaussia luciferase، كما هو مشار إليه في البروتوكول النصي.

في أنبوب معقم ، امزج 100 ميكرولتر من 100 ميكرومولار CHLA أو PUG مع 100 ميكرولتر من 10 إلى وحدات تشكيل التركيز الرابعة أو FFU من HCV. للحصول على تحكم إيجابي ، اخلطي HCV مع الهيبارين بتركيز نهائي قدره 1,000 ميكروغرام لكل ملليلتر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

بعد ثلاث ساعات ، قم بتخفيف خليط مركب الفيروس 50 ضعفا مع 9.8 مل من الوسط القاعدي في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط مركب فيروسات جديد ، وقم بتخفيف هذا الخليط على الفور في الوسط القاعدي لعينة حضانة ساعة الصفر. بعد إزالة وسط الحضانة من الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول دواء الفيروس المخفف لكل بئر في ثلاث نسخ

المحلول الآن على 10 إلى FFU الثاني لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات للسماح بالعدوى الفيروسية للخلايا. بعد الحضانة ، قم بإزالة المعلق الفيروسي من الآبار وغسل الخلايا برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS مرتين.

احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من الوسط القاعدي لمدة 72 ساعة لتكاثر الفيروس وإطلاق مراسل لوسيفيراز في المادة الطافية. بعد ذلك ، اجمع المواد الطافية من الثقافات في الأنابيب الدقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 17,000 مرة جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي. امزج 20 ميكرولترا من كل مادة طافية مع 50 ميكرولترا من كاشف فحص Gaussia luciferase ، وقم بقياس اللمعان من نشاط مراسل luciferase في مقياس الإضاءة.