موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 2:56 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بزرع ثقافة بكتيرية في لوحة فحص. ثم احتضن اللوحة.
تحتويالخلايا البكتيرية على مواد لاصقة سطحية وبيلي تمكنها من الالتصاق ببعضها البعض ، وتشكيل مجاميع صغيرة.
أضف تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية إلى الآبار ، مع ترك واحدة دون معالجة للمراقبة.
تتفاعل جزيئات المضادات الحيوية مع البكتيريا الحساسة ، مما يؤثر على قدرتها على النمو والتكاثر ، مما يؤدي إلى وفاتها.
تظل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية نشطة في التمثيل الغذائي ، وتنتج جزيئات ATP.
استخدم جهاز صوتي لتعطيل الخلايا البكتيرية ، وإطلاق محتوياتها داخل الخلايا ، بما في ذلك ATP.
أضف كاشف توهج استخدام ATP الذي يحتوي على لوسيفيرين وإنزيم لوسيفيراز وعوامل مساعدة أخرى.
يستخدملوسيفيراز ATP والأكسجين لتحويل لوسيفيرين إلى أوكسيلوسيفيرين متحمس.
ينتقل الأوكسيلوسيفيرين لاحقا إلى حالته الأرضية ، وينبعث منه ضوء مضيء.
قم بقياس الامتصاص باستخدام قارئ لوحة.
يشيرانخفاض الامتصاص عند تركيزات المضادات الحيوية العالية إلى انخفاض إنتاج ATP ، مما يشير إلى انخفاض معدل بقاء البكتيريا.
قم بقياس الكثافة الضوئية عند 650 نانومتر أو OD650 لتحديد تركيز البكتيريا العالقة ، واضبط تركيز GC إلى حوالي 1 × 108 وحدات تشكيل مستعمرة لكل مليلتر. بعد ذلك ، أضف 99 ميكرولترا من معلق GC في آبار فردية من صفيحة 96 بئرا ، واترك البكتيريا تتجمع عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 6 ساعات.
في نهاية الحضانة ، أضف 1 ميكرولتر من السيفترياكسون المخفف بشكل متسلسل إلى كل بئر ، مع ترك بعض الآبار غير معالجة لتكون بمثابة عناصر تحكم ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم التالي ، صوتنة التعليق في كل بئر ثلاث مرات عند 144 واط و 20 كيلوهرتز لمدة 5 ثوان لكل صوتنة ، وأضف 100 ميكرولتر من كاشف توهج استخدام ATP المتاح تجاريا إلى كل بئر.
انقل بعناية 150 ميكرولترا من الخليط من كل بئر إلى آبار فردية لصفيحة سوداء جديدة مكونة من 96 بئرا وقم بقياس امتصاص كل بئر عند 560 نانومتر على قارئ الألواح. بعد ذلك ، احسب معدل البقاء على قيد الحياة بنسبة القراءة التي تم الحصول عليها بعد العلاج بالمضادات الحيوية التسلسلية إلى القراءة من الآبار غير المعالجة.