التصور القائم على الفحص المجهري TIRF لتشكيل البلعمة وإغلاقها

خذ طبقا زجاجيا مطلي بالبوليمر يحتوي على خلايا الدم الحمراء المتوافقة مع IgG أو كرات الدم الحمراء الملتصقة بسطحه.

ضع الطبق على مرحلة المجهر الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي ، مع الحفاظ عليه في درجة حرارة فسيولوجية.

أضف البلاعم التي تحتوي على ببتيدات سيتوبلازمية مصنفة فلورسنت ترتبط بالأكتين المبلمر ، مما يسهل تصور الهيكل الخلوي.

أثناء التصوير ، قم بتوجيه شعاع الليزر بزاوية أعلى من الزاوية الحرجة ، مما يتسبب في انعكاس داخلي وتوليد موجة زائلة عند نقطة الاتصال.

تضيء الموجات الزائلة بشكل انتقائي الفلوروفورات في واجهة العينة الزجاجية ، مما يسمح بالتصور في الوقت الفعلي للبلعمة.

ترتبط مستقبلات Fc للبلاعم بكرات الدم الحمراء IgG-opsonized ، مما يتسبب في تجمع المستقبلات حول منطقة التلامس.

التجميع إلى تشغيل مسارات الإشارات داخل الخلايا وتنشيط GTPase ، مما يؤدي إلى بلمرة الأكتين وتجنيد الدينامين ، وتشكيل الكاذب.

تمتد الأرجل الكاذبة حول كرات الدم الحمراء ، وتشكل كوبا بلعمة.

في النهاية ، تندمج أطراف الأرجل الكاذبة. يتوسط الدينامين المتراكم في انفصال البلعمة عن غشاء الخلية ، مما يؤدي إلى استيعاب كرات الدم الحمراء المضادة.

للتثبيت غير التساهمي ل SRBCs ، صب 2 ملليلتر من الخلايا المضادة ل IgG في كل من الأطباق المطلية بالبولي ليسين ، وقم بالطرد المركزي للعينات في جهاز طرد مركزي دوار متأرجح. تخلص من المواد الطافية ، واغسل الجزيئات مرة واحدة باستخدام 2 مل من PBS بالإضافة إلى 10٪ BSA.

بعد ذلك ، احتضن الجسيمات ب 2 مل من PBS الطازج بالإضافة إلى 10٪ BSA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بثلاث غسلات مع 2 مل من PBS. بعد الغسيل الأخير ، استبدل PBS ب 2 ملليلتر من وسط الفحص المجهري الخالي من المصل 37 درجة مئوية.

ضع طبقا مشفرا ب SRBC على مرحلة المجهر. بعد ذلك ، اكشط الخلايا المنقولة ذات الأهمية من قاع طبق المزرعة وقم بماصة الخلايا عدة مرات لتحقيق تعليق أحادي الخلية. أضف الخلايا المنقولة إلى الطبق المغطى ب SRBC.

ابدأ برنامج الاستحواذ المباشر. ابحث عن خلية تعبر عن البروتينات الموسومة بالفلورسنت واضبط موضع الطبق بحيث تكون الخلية ذات الأهمية في منتصف الحقل. احصل على 500 صورة بزوايا مختلفة من 0 إلى 5 درجات بزيادات قدرها 0.01 درجة بطول موجة إثارة واحد.

لتحديد الزاوية الحرجة لانعكاس الضوء الساقط بالكامل على الواجهة الزجاجية المتوسطة وتوليد موجة زائلة ، افتح تسلسل الصورة في برنامج التصوير المناسب. حدد منطقة الاهتمام في الخلية ذات التألق المنتظم.

ثم ، ضمن علامة التبويب صورة ، حدد المكدسات وارسم ملف تعريف المحور Z. لرسم ملف تعريف المحور Z ، يعني شدة التألق المقاسة في منطقة الاهتمام مع وظيفة الزوايا على المحور X. يمكن بعد ذلك استخدام أي قيمة زاوية على المحور x أعلى من الزاوية الحرجة أثناء جلسة الفحص المجهري للحصول على إشارة TIRF.