اختبار قائم على الخلايا لتقييم امتصاص بروتين تاو بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة

ابدأ بصفيحة مسطحة القاع متعددة الآبار تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة الملتصقة بالفئران - الخلايا البلعمية في الدماغ.

إدخال وسط خال من المصل يحتوي على مجمعات مناعية. تتكون هذه المجمعات من أجسام مضادة مرتبطة بمجاميع بروتين تاو الفسفرية ، والتي تتشكل خلال بعض الأمراض التنكسية العصبية.

يتم تصنيف مجاميع تاو بصبغة فلورية خضراء حساسة للأس الهيدروجيني.

أثناء الحضانة ، تتفاعل هذه المجمعات المناعية مع مستقبلات Fc للخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يسهل ابتلاعها.

يندمج هذا الجسيم الداخلي المحتوي على المركب المناعي مع الليزوزوم ، مكونا الجسيم الداخلي. تتسبب البيئة الحمضية للجسيم الداخلي في تألق جزيئات الصبغة.

يغسل لإزالة المجمعات المناعية غير الداخلية.

عالج بمحلول التربسين EDTA لفصل الخلايا.

انقل تعليق الخلية إلى صفيحة قاع على شكل حرف U موضوعة فوق الجليد لتثبيت الجسيم الداخلي. حبيبات الخلايا والتخلص من المادة الطافية.

اغسل الخلايا وأعد تعليقها باستخدام عازلة FACS.

باستخدام FACS ، حدد الخلايا الحية المفردة وحدد كثافة التألق الأخضر لتقييم امتصاص تاو بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة.

في اليوم الأول من التجربة ، قم بإعداد خلايا BV-2 عن طريق غسلها أولا باستخدام 1x PBS في القارورة التي تمت زراعتها فيها. ثم احتضنها بنسبة 0.05٪ تريبسين EDTA عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى تنفصل عن القارورة. أعد تعليق الخلايا في وسط المزرعة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل من 3 إلى 5 مرات.

عد الخلايا وإعداد معلق الخلية بتركيز نهائي يبلغ 100,000 خلية لكل مليلتر في وسط استزراع يحتوي على 200 ميكروغرام لكل مليلتر من الهيبارين. أضف 250 ميكرولترا من معلق الخلية هذا لكل بئر في صفيحة مسطحة القاع لزراعة الأنسجة 96 بئرا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ بين عشية وضحاها.

بعد إذابة مجاميع صبغة الأس الهيدروجيني المعدة مسبقا على الجليد ، قم بتخفيفها في 65 ميكرولتر لكل حالة من الوسط الخالي من المصل لعمل محلول 500 نانومولار. تمييع الأجسام المضادة في 65 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل لتحقيق ضعف التركيز المطلوب. امزج مجاميع صبغة الأس الهيدروجيني والأجسام المضادة في صفيحة قاع على شكل حرف U سعة 96 بئرا. أغلق لوحة التخفيف هذه واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسط من اللوحة المكونة من 96 بئرا مع خلايا BV-2. اغسل الخلايا في كل بئر ب 100 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 1x PBS. قم بإزالة PBS من لوحة خلية BV-2. استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 125 ميكرولترا من المجمعات المناعية من لوحة التخفيف إلى كل بئر من صفيحة خلية BV-2 سعة 96 بئرا، واحتضانها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

بعد الحضانة ، قم بإزالة المجمعات المناعية من الخلايا وغسل الخلايا في كل بئر ب 100 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 1x PBS. بعد إزالة 1x PBS ، أضف 50 ميكرولترا من 0.25٪ trypsin-EDTA ، واحتضن لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع وأعد تعليق البئر عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا.

انقل الخلايا إلى صفيحة قاع على شكل حرف U سعة 96 بئرا وقم بطردها بمعدل 400 مرة جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ضع الطبق على الثلج وقم بإزالة الوسط. أضف 150 ميكرولترا من الثلج البارد 1x PBS ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 400 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ضع الطبق على الثلج واغسله مرة أخرى عن طريق إزالة 1x PBS المضاف مسبقا وإضافة 150 ميكرولتر من PBS المثلج لكل بئر. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف.

ضع اللوحة على الثلج واغسل الخلايا عن طريق إزالة PBS المضاف مسبقا ، وإضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل بئر. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 400 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ضع اللوحة على الثلج ، وقم بإزالة المخزن المؤقت FACS المضاف مسبقا ، وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل بئر. انتقل على الفور إلى التحليل بواسطة FACS للحصول على 20,000 حدث في بوابة الخلية الحية.