الليزر Microdissection القبض على أنسجة الثدييات

مرحباً، اسمي روب إدواردز. أنا مدير مرفق مجهر الالتقاط بالليزر في جامعة كاليفورنيا إيرفين. سأقوم بشرح كيفية استخدام مجهر الالتقاط بالليزر المتوفر لدينا هنا.

جهازنا هو Leica A-S-L-M-D، والذي اشتريناه منذ ثلاث سنوات تقريباً. هناك نوعان مختلفان من أنظمة الالتقاط بالليزر؛ أحدهما يشبه آلة لحام البقع، حيث توضع قطعة من النسيج على شريحة زجاجية فوق غشاء بلاستيكي يغطي النسيج.

يُستخدم بعد ذلك مصدر ليزر لصهر الغشاء، مما يؤدي فعلياً إلى لحام النسيج بالنقطة على الغشاء، ومن ثم يتم إزالة ذلك الغشاء، ساحباً معه النسيج الملتقط. حسناً، لبدء تشغيل نظام LCM، نقوم بتشغيل عدد من الأجهزة بالتتابع هنا. سنبدأ بصندوق تحكم A-S-L-M-D، الذي يتم تشغيله من هنا.

نقوم بعد ذلك بتشغيل الكمبيوتر ببساطة. وإذا كانت لديك عينة تتطلب بصريات فلورية لتحديد الخلايا المراد التقاطها، فستقوم بتشغيل مصباح الزئبق للإضاءة الفلورية. لن نستخدم ذلك في هذا العرض التوضيحي.

إذا كنت ترغب في التقاط صور عالية الجودة للعينات قبل وبعد المعالجة، يمكن تشغيل كاميرا البقعة (spot camera) بشكل منفصل هنا بعد تشغيل صندوق المنطق والحاسوب، ثم يتم بعد ذلك تشغيل وحدة التحكم في طاقة الليزر الموجودة هنا، والتي يتم تشغيلها في الواقع بواسطة مفتاح موجود في الجزء السفلي من الجهاز. وأخيراً، يتم تشغيل شاشة الحاسوب. هناك عدد من أدوات التحكم الموجودة على الشاشة التي ستحتاج إلى الإلمام بها.

ستستخدم هذه الأدوات بانتظام. هذا برنامج تقليدي يعتمد على نظام التشغيل Microsoft Windows، لذا هناك عدد من القوائم التي سنناقشها. ولكن دعوني أتحدث أولاً عن سطح المكتب هنا.

توجد نافذة عرض مباشرة توضح ما يراه المجهر في الواقع. وفي شريط القائمة هنا، يمكنك رؤية زر للصور المباشرة، كما يوجد زر تجميد (freeze) يمكنك تفعيله ثم استخدام قائمة الملفات لالتقاط صور ثابتة لجزء من النسيج، على سبيل المثال قبل الالتقاط ثم بعد الالتقاط لتوثيق النسيج الذي قمت بعزله. يمكن للمجهر أن يعمل إما في وضع المجال المضيء (brightfield) أو وضع الفلورة (fluorescence)، اعتماداً على ما إذا كنت تقوم بتصوير نسيج مصبوغ بصبغة الهيماتين المضادة أو نسيج مصبوغ بصبغة فلورية.

يتضمن الزران التاليان وضع العينة، الذي يركز على مستوى منصة المجهر، ثم يوجد وضع التجميع الذي يقوم بإبعاد الشريحة الزجاجية ليتيح لك رؤية الأنسجة التي تم التقاطها في الجزء العلوي من أنبوب التجميع. ويعد هذا الإعداد نوعاً من إعدادات مراقبة الجودة. يلي ذلك في شريط القائمة عدد من أدوات الرسم، والتي ستستخدمها لتحديد أجزاء الأنسجة أو الخلايا التي ترغب في التقاطها.

وبعد ذلك، تظهر على الجانب الأيمن من الشاشة بعض أدوات الرسم والالتقاط الإضافية، بما في ذلك خيارات لأشكال الرسم، وبعض خيارات القطع، ثم أزرار التحكم في القطع. كما يوجد في لوحة التحكم هنا في الأسفل جهاز التجميع، وهو جزء المجهر الموجود أسفل المنصة، والذي يحمل أنابيب "إينور" التي يتم فيها التقاط النسيج. وتتحكم هذه الأزرار الأربعة المحددة بـ A وB وC وD في الأنبوب الذي سيتم نقله مباشرة تحت العينة التي يتم التقاطها.

هذا مثال لنسيج نموذجي من المقاطع المجمدة التي تمت معالجتها من أجل التشريح الدقيق بالتقاط الليزر. هذه مقاطع إكليلية لرأس جنين فأر تم التقاطها على شريحة غشاء قلم (pen foil). كانت هذه مقاطع مجمدة بسمك 8 micron، جُففت بعد ذلك وصُبغت بصبغة الهيماتين المضادة، ثم خُزنت عند درجة حرارة -80 °C حتى وقت الاستخدام.

وبالتالي، لتثبيت هذه الشرائح على المجهر، يأتي المجهر مع حامل خاص، وتذكر أن النسيج سيتم التقاطه في أنبوب einor يقع أسفل مستوى المنصة. ولذلك، يكون النسيج على هذا الجانب من الشريحة، لذا سيتم تثبيتها في حامل الشرائح بحيث يكون جانب النسيج متجهاً للأسفل على النحو التالي.

توضع الشريحة في مكانها ويتم تثبيتها بواسطة ضغط الزنبرك. ومن ثم، تظل هذه الفتحة سليمة. يوضع حامل الشرائح على منصة المجهر بين هذين الدليلين.

ستلاحظ وجود نتوء صغير يستقر أسفل مشبك في الجزء الخلفي من المنصة لتثبيت العينة في مكانها. وعند إدخاله، ستشعر بطقة تأكيد. حسنًا، الشيء التالي الذي يجب تجهيزه هو أنابيب einor، والتي ستعمل فعلياً على التقاط النسيج.

يمكن للمستخدم اختيار استخدام أنابيب einor سعة 0.2 أو 0.5 milliliter، وهي تتناسب مع هذه الحوامل الصغيرة التي توضع بدورها في هذه الصينية، والتي يتم إدخالها في فتحة خاصة أسفل المنصة. وبذلك، يتم التقاط النسيج فعلياً داخل الجزء العلوي من غطاء أنبوب einor. وبالنسبة لأنبوب einor، فإنني أستخدم هنا أنبوباً سعة 0.5 milliliter لأغراض التوضيح.

يتم إدخال الغطاء بهذا الشكل، حيث يتم سحبه للأسفل ومن ثم تثبيت حواف الغطاء بواسطة تلك الأسنان، ثم يشبك الغطاء من الأسفل بهذه الطريقة، وبعد ذلك يوضع الغطاء بالكامل في الحامل. الآن، في حال كان الهدف هو استخلاص الأحماض النووية، وتحديداً لعزل RNA، يمكن وضع قطرة بحجم عدة مئات من الـ µL من محلول triol مباشرة في الغطاء. ومن المهم بالطبع عدم سكب هذا المحلول داخل الجهاز، وذلك بسبب وجود الفينول والمواد الكيميائية الكاوية الأخرى في كاشف triol.

هذا هو متحكم المجهر كما ذكرت سابقاً، حيث تكون العدسات الشيئية والإضاءة والتركيز آلية بالكامل في هذا الجهاز. لذا، يوجد مقبض التركيز هنا في الأعلى. أما مقبض التحكم في إزاحة المسرح على محور Y فهو هذا المقبض.

يوجد هنا نظام التحكم في ترجمة المحور X. وفي الأسفل إلى اليسار يوجد التحكم في القزحية، والذي يعمل على تغيير مستوى الإضاءة، كما يحفظ المجهر مستوى الإضاءة الذي تم ضبطه عند كل تكبير. لذا، عند التغيير من عدسة شيئية إلى أخرى، يتم ضبط الإضاءة تلقائيًا.

وفي النهاية، يوجد على الجانب الأيمن من وحدة التحكم مفتاح التحكم في قرص العدسات الشيئية الذي يسمح بالتنقل بين العدسات. يحتوي هذا الجهاز على خمس عدسات شيئية، وهي: 4x، و10x، و20x، و40x، و63x. وتتمثل الخطوة الأولى في عملية تصوير الأنسجة فعلياً في ضبط محاذاة المجهر لضمان أن ما يظهر على الشاشة هو بالضبط ما سيتم تصويره، وذلك من أجل محاذاة المجهر.

ننتقل إلى خيار قائمة الليزر ونختار معايرة (calibrate)، ثم نضغط على متابعة للموافقة. أنا الآن في إعداد 4x، ويمكنكم رؤية منطقة كبيرة نسبيًا من الغشاء هنا. لاحظ عدم وجود نسيج.

نقوم بإجراء عملية المحاذاة عند أحد أركان الشريحة. لقد قام الليزر بقص علامة تقاطع في الزاوية العلوية اليمنى من الشاشة، وسأستخدم الفأرة لتوسيطها في تلك الشاشة ثم أنقر، ليقوم الكمبيوتر بقص علامة تقاطع أخرى. سأقوم بالمحاذاة مع تلك العلامة وأنقر، ثم يقوم الجهاز بقص علامة تقاطع ثالثة ونقوم بالمحاذاة عندها.

اكتملت الآن عملية معايرة العدسة الشيئية ذات التكبير 4x للمجهر، وأصبح الآن محاذياً وجاهزاً لالتقاط صور للأنسجة بالفعل. قد تلاحظ خلال عملية المحاذاة أن الخطوط المتقاطعة التي تم قطعها كانت سميكة نوعاً ما، ويعود ذلك في الواقع إلى ضبط قدرة التحكم في الليزر على إعداد عالٍ جداً.

ربما لا نحتاج إلى تلك الدرجة من قوة القطع. لذا سأوضح كيفية ضبط قدرة الليزر عن طريق قطع خط. وإذا رسمتُ بيدي خطاً قطرياً على الشاشة، ثم اخترتُ غطاءً، وبعد ذلك انتقلتُ وضغطتُ على بدء القطع (start cut)، سيقوم الكمبيوتر بالقطع على طول الخط الذي حددته.

ويمكنكم رؤية مدى عرض هذا الخط. يجب عليّ تقليل قدرة الليزر، لذا سأقوم بذلك.

أنتقل إلى قائمة الليزر، ثم إلى التحكم، وستلاحظ أن الشدة قد وصلت إلى حدها الأقصى. سأقوم بخفض شدة الليزر إلى 30 تقريبًا وأعتمد هذا الإعداد. الآن، إذا رسمت خطًا جديدًا وقمت بقطعه، ستلاحظ أن عرض الأنسجة المحترقة أو الغشاء المحترق أصبح أقل بكثير.

وبناءً على ذلك، وكقاعدة عامة، يجب ضبط قدرة التحكم في الليزر على أدنى إعداد ممكن لتقليل كمية الأنسجة التي يتم تبخيرها. وسأقوم الآن بتوضيح عملية التقاط بعض الأنسجة باستخدام هذه العين المرآتية. أنا أستخدم حالياً عدسة الشيئية 4x وسأحاول التقاط جزء كبير نسبياً من النسيج.

سنقوم بعزل العدسة بأكملها من مركز هذه العين. وللقيام بذلك، سأقوم بالقص يدويًا. وبناءً على ذلك، سأستخدم أداة التحكم في الرسم الموجودة في أعلى الشاشة للقص.

سأقوم برسم خط حول العينة المراد التقاطها، وأنا أفعل ذلك بتكبير منخفض للغاية. إذا كان الباحث مهتماً بقصات أكثر دقة أو مساحات أصغر من الأنسجة، فمن الواضح أنه يمكنه الالتقاط بتكبير أعلى.

لقد قمت بتحديد المنطقة المراد قطعها، وسأنتقل إلى قائمة رسم الأشكال (draw shapes)، وعادةً ما أبقي خيار الخطوط المغلقة (closed lines) مفعلاً. وظيفة الخطوط المغلقة هي أنه في حال رسم شكل غير منتظم حول شيء ما وعدم إغلاق الشكل تماماً حول الجسم المراد التقاطه، يقوم البرنامج برسم خط مستقيم يربط بين النهايات المفتوحة للشكل. وبمجرد تحديد المنطقة المراد قطعها، سنبدأ عملية القطع، وستلاحظ أن صندوق التحكم يوجه الليزر عبر المناطق المحددة ويقوم بقطعها بشكل شبه كامل.

غالبًا ما نواجه مشكلة بقاء أجزاء صغيرة عالقة (hanging Chad) عند التقاط قطع كبيرة من الأنسجة، حيث لا يحدث فصل كامل للنسيج. لذا، فإن أول إجراء يجب تجربته هو إعادة القطع ببساطة، وسيقوم الليزر بتتبع محيط النسيج.

في بعض الأحيان، يمكنك بدلاً من ذلك ببساطة، في مكان تعليق العينة، رسم مساحة صغيرة وقطعها وعندئذٍ ستسقط العينة. وبذلك نكون قد استخلصنا هذا الجزء من النسيج. وكما ذكرت سابقاً، يمكننا الانتقال إلى وضع الجمع (collector mode) والتحقق من أن قطعة النسيج تلك موجودة بالفعل في المجمع أو في غطاء أنبوب einor.

لذا، سأنتقل إلى زر التحكم في المجمع، وأضغط عليه، وستلاحظون أن المجهر سيقوم الآن بتغيير العرض. نحن ننظر الآن إلى السطح الداخلي لأنبوب einor، وهناك قطعة النسيج التي تم التقاطها في الجزء السفلي الأيمن من الشاشة، وسأقوم بضبط التركيز لرؤية الخلايا الفردية. وهكذا تحققنا من أننا قد التقطنا بالفعل النسيج الذي اخترناه.

والآن، لا تتم عملية الالتقاط بكفاءة مئة بالمئة لأن هذه الأنسجة التي يتم التقاطها تشبه في الأساس الأوراق المتساقطة. فهناك نسبة مئوية صغيرة من شظايا الأنسجة الملتقطة لن تسقط داخل غطاء أنبوب einor، ولكن معدل الفقد يكون منخفضاً جداً بمجرد الانتهاء من التقاط النسيج المطلوب. الخطوة التالية، بطبيعة الحال، هي إخراج أنبوب einor الذي يحتوي على النسيج الملتقط من الجهاز وإغلاق غطائه بإحكام.

وللقيام بذلك، نسحب الحامل بلطف شديد إلى الخارج مباشرة بهذا الشكل. ومع مراعاة ضرورة بقاء غطاء الأنبوب في وضع عمودي، يتم إخراج الحامل من الصينية ثم سحب الأنبوب للخارج بلطف شديد. اسحبه بهذا الشكل، وأخرجه من الحامل، ثم حرك الأنبوب، وليس الغطاء، بهذا الشكل.

الآن، إذا كنت قد وضعت بالفعل قطرة من triol في الغطاء، فستبدأ أنسجتك بالفعل في عملية الإذابة، ويمكنك العودة إلى مختبرك وإكمال عملية عزل RNA. هناك عدد من الشركات المصنعة التي تنتج مجموعات عزل RNA بمقياس ميكروي، ونحن نفضل الشركة المصنعة Amon. وهذا كل ما في الأمر.

لقد استعرضت معكم اليوم مرفق مجهر الالتقاط بالليزر هنا في جامعة كاليفورنيا، إيرفاين (UC Irvine). وقد أوضحنا كيفية التقاط مقاطع نسيجية مجمدة من شرائح مغطاة برقائق البن فويل (pen foil) تمهيداً لعزل الـ RNA من تلك الأنسجة. أشكركم على حسن استماعكم، وأتمنى لكم كل التوفيق في تجاربكم الخاصة في التشريح الدقيق بالالتقاط بالليزر.