اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات مجمع المتفطرة السل للأدوية الخط الأول والثاني عن طريق التخفيف في شكل حساء بلايت Microtiter

هناك عدد قليل نسبيا من الأدوية المتاحة لعلاج المتفطرة السلية ، لذا فإن مقاومة أي دواء هي مصدر قلق. تصف مقالة الفيديو هذه إجراء لاختبار مقاومة السل M للمضادات الحيوية ل 12 دواء جرثويا مختلفا في وقت واحد. وبالتالي ، فإن القدرة على الكشف السريع عن مقاومة مضادات الميكروبات لمرض السل M مهمة جدا في الجهود المبذولة للسيطرة على زيادة سلالات المقاومة هنا لاختبار قابلية المضادات الحيوية.

يزرع مرض السل M لأول مرة على وسط صلب أو في مرق ، وهو معلق بكتيري. يتم تحضير اللقاح وإضافته إلى صفيحة ميكروتيتر تحتوي على تركيزات مختلفة من 12 دواء، بما في ذلك أدوية الخط الأول والثاني بعد الحضانة. يتم تحديد مدى النمو في كل بئر إما يدويا باستخدام صندوق مرآة أو باستخدام قارئ لوحة شبه آلي.

وتشير البيانات الناتجة إلى الحد الأدنى من التركيز المثبط لكل دواء تم اختباره وتبين المضادات الحيوية التي تقاوم سلالة السل المختبرة. تساعد هذه النتائج في اختيار الدواء المناسب لعلاج السل. مرحبا، اسمي نانسي إيك وأنا مديرة مختبر مايكو لعلم الجراثيم في مايو كلينك في روتشستر بولاية مينيسوتا.

سنصف اليوم طريقة لإجراء اختبار الحساسية للمضادات الحيوية لبكتيريا السل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تخفيف المرق الكلي هي أنه يتم تحديد MIC لكل دواء ويتم اختبار 12 نوعا حيويا في وقت واحد. سيوضح الإجراء كورت جود ، أخصائي الجودة في مختبري ، الذي يعمل على مقعد مختبر.

استعد لهذا الإجراء عن طريق وضع ملصقات على لوحة أجار الدم ، وثلاث لوحات من Middlebrooks سبع H 10 ، وأنبوب حبة زجاجية من المراهقة المالحة ، ولوحة ميكروتيتر تحمل اسم المريض ورقم تعريف العينة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتسمية أجار الدم وسبع لوحات H 10 على أنها نقاء. تحقق من تسمية إحدى لوحات H 10 السبع هذه على أنها عدد مستعمرات واحد إلى واحد والآخر على أنه واحد إلى 50 مستعمرة.

ثم ضع الدرج في الممر. بعد ذلك ، استعد للعمل في منشأة السلامة البيولوجية BSL الثالثة من المستوى الثالث من خلال ارتداء ثوب أمامي صلب وقفازات غطاء الرأس وأغطية أحذية وجهاز تنفس. هنا ، يتم استخدام جهاز التنفس الصناعي بابا.

ثم استرجع الدرج من التمرير. بعد ذلك في منشأة BSL الثلاثة ، قم بتطهير سطح خزانة السلامة البيولوجية. ثم ضع منشفة ورقية مبللة بمطهر داخل الغطاء ، على بعد حوالي ست بوصات من لوحة فتحة التهوية بجوار المنشفة الورقية.

ضع حلقات التلقيح ، والماصات والنصائح ، وحاوية مناسبة للتخلص من النفايات ، و nephi ، و TER ، ودوامة. بمجرد تحضير الغطاء ، ضع الكائن الحي على المنشفة الورقية جنبا إلى جنب مع رف به مرق McFarland 0.5 Standard A seven H nine مع OADC وأنبوب حبة ملحية. يتم هذا الإعداد من صلب ومتوسط.

تحضير اللقاح من ثقافة متوسطة صلبة من عينة المريض. استخدم حلقة معقمة لكشط المستعمرات ونقلها إلى أنبوب الخرزة الزجاجية المالحة. دوامة التعليق لمدة 30 إلى 60 ثانية.

افحص العينة بصريا ، ومقارنتها بمعيار ماكفارلاند. يجب أن يكون المبلغ المحول مساويا أو أكبر من المعيار. إذا لم يكن الأمر كذلك ، أضف المزيد من العينة البكتيرية والدوامة. مرة أخرى.

بمجرد مطابقة معيار McFarland ، اترك اللقاح يستقر لمدة 15 دقيقة للسماح لكتل أكبر من البكتيريا بالاستقرار. بعد ذلك ، استخدم nefi TER لقياس كثافة البكتيريا العالقة إلى الصفر. نيفي تير.

ضع أولا أنبوبا فارغا من حبة الملح في nephi. اضغط على زر المعايرة لتصفير الجهاز ، ثم ضع معيار McFarland 0.5 في Nephi ter واضغط على زر المعايرة مرة أخرى. بمجرد معايرة الجهاز ، قم بإزالة معيار McFarland وأدخل اللقاح.

يجب أن تكون قراءة اللقاح مساوية للقراءة القياسية ل McFarland. إذا كانت القراءة منخفضة جدا ، فقم بإزالة الأنبوب ونقل المزيد من البكتيريا من اللوحة. ثم الدوامة وقراءة العينة مرة أخرى.

إذا كانت القراءة عالية جدا ، أضف المحلول الملحي إلى دوامة الأنبوب. ثم اقرأ العينة مرة أخرى. استمر في ضبط اللقاح حسب الحاجة حتى يتطابق تركيز البكتيريا مع معيار ماكفارلاند.

بعد ذلك، استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر وطرف ماصة طويل مقاوم للهباء الجوي لإزالة 100 ميكرولتر من اللقاح من الثلث العلوي من الأنبوب. لتجنب أي كتل تستقر في الجزء السفلي من التلقيح ، يقوم مرق Middlebrook seven H nine بدوامة المرق الملقح ببطء لمدة 20 ثانية للوحة اللقاح ابدأ بإزالة لوحة الميكروتيتر من عبوة الشركة المصنعة. إذا كان المجفف أزرق اللون أو إذا كانت عبوة الرقائق تالفة ، فلا تستخدمه.

اللوحة بالفعل على 12 مضادا للميكروبات ليتم اختبارها في كل بئر ، بما في ذلك أدوية الخط الأول الأكثر فعالية وأدوية الخط الثاني. اسكب بعناية لقاح المرق السبعة H تسعة في trth مع الحرص على عدم توليد الهباء الجوي. ثم ضع لوحة المعايرة الدقيقة بحيث يكون الملصق متجها للخارج كما هو موضح هنا ، واستخدم ماصة 12 قناة لإضافة 100 ميكرولتر من اللقاح إلى كل بئر.

بعد ذلك ، قم بإعداد لوحات لأداء عمليات العد. أولا ، قم بإعداد لوحة غير مخففة عن طريق نقل حلقة ميكرولتر واحد من العينة من بئر التحكم الإيجابي إلى لوحة H 10 السبعة المسماة واحدا إلى واحد. ثم استخدم الحلقة لرسم اللوحة كما هو موضح هنا.

بعد ذلك ، لتحضير تخفيف من واحد إلى 50 ، قم بنقل حلقة ميكرولتر واحد من بئر التحكم الإيجابي وقم بتدويرها في الأنبوب مع 50 ميكرولتر من خط الماء. ميكرولتر واحد من هذا التخفيف على اللوحة المسمى واحد إلى 50. قم بتلقيح ألواح النقاء عن طريق سحب 50 ميكرولترا من اللقاح من trth على أجار الدم المسمى بشكل مناسب وسبع ألواح H 10 وخط للعزل.

ثم قم بتكديس ترث آخر فوق الترث الملقح وضعه برفق في حاوية المهملات. ضع ختما لاصقا على لوحة الميكروتيتر. ثم باستخدام الدعامة البيضاء ، اضغط بقوة على كل بئر لضمان السقف المناسب ، مع التأكد من عدم وجود تجاعيد.

قم بتطهير لوحة العيار الدقيقة عن طريق مسحها بمنشفة ورقية مبللة بمطهر مبيد السل. ثم ضع لوحة الميكروتيتر في كيس بلاستيكي وأغلقها بختم حراري. أخيرا ، قم بتطهير جميع المواد ، بما في ذلك nephi و lter vortex وألواح وأنابيب عن طريق مسحها بمطهر مبيد السل.

هنا يتم استخدام رذاذ pro بعد مرور وقت كاف لضمان التطهير. 15 دقيقة للرذاذ الاحترافي. يتم لصق الألواح بشريط سكوتش يوضع في أكياس بلاستيكية ويتم إزالة الإمدادات المختومة من خزانة السلامة الحيوية ووضعها في الممر.

إغلاق الحقيبة الحمراء المهملة وإغلاقها بربطة عنق ملتوية في هذه المرحلة ، وإزالة الثوب والجوارب والقفازات. بعد الانتقال إلى غرفة الردهة وغسل اليدين ، قم بإزالة جهاز التنفس الصناعي وتطهيره وتخزينه بعد غسل اليدين مرة أخرى ، وارتد ثوبا جديدا واترك جناح BSL الثلاثة. بعد ذلك ، يتم تعقيم حاوية التجاهل.

بعد ذلك ، احتضان صفيحة الميكروتيتر وألواح H 10 السبعة ومثقاب الدم على الجانب الأيمن لأعلى في حاضنة 35 إلى 37 درجة مئوية مع خمسة إلى 10٪ CO2 في مختبر BSL الثاني. هذا مقبول لأن اللوحة محكمة الغلق وفي كيس بلاستيكي ، يتراوح الوقت من 12 إلى 24 ساعة تقريبا ، لذلك سيستغرق الأمر أسبوعا على الأقل قبل أن ينظر إلى النمو على أنه تكوين حبيبات خلية في الجزء السفلي من عنصر التحكم. حسنا ، في اليوم 10 ، قم بإجراء قراءة يدوية للمرآة عن طريق وضع شفرة ST micro titter محكمة الغلق على منصة صندوق المرآة.

استخدم مصباحا مكتبيا للمساعدة في تصور النمو القابل للتعديل حسب الحاجة للحصول على أفضل تباين. تحقق من آبار التحكم في النمو في هذه الحالة ، H 11 و H 12 من خلال النظر إلى المرآة. إذا كان هناك نمو ، فسيبدو البئر غائما أو يبدو أنه يحتوي على رواسب كما هو موضح هنا.

إذا لم يكن هناك نمو كما هو موضح في هذا المثال ، فسيبدو البئر واضحا. في هذه الحالة ، ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة واستمر في الحضانة لمدة تصل إلى 21 يوما. لكل حالة ، قارن النمو بعنصر التحكم.

حسنا ، لكل سجل دوائي ، التخفيف الأول الذي ليس له نمو. هذا هو الحد الأدنى من التركيز المثبط أو MIC للدواء لفحص النتائج باستخدام قارئ لوحة آلي مثل الرؤية تبدأ بفتح برنامج لوحة Myco TB a ST وتسجيل الدخول في مكان اللوحة المختومة مع توجيه الباركود للخارج. كما هو موضح هنا ، يظهر النمو على شكل تعكر أو كرواسب للخلايا في قاع بئر على شاشة الكمبيوتر.

أولا ، افحص ضوابط النمو. كما كان من قبل. إذا كان هذا سلبيا للنمو ، فضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة تصل إلى 21 يوما.

إذا كان هذا إيجابيا ، فقم بتسجيل النتائج عن طريق لمس البئر الأول ، الذي لا يظهر نموا على الشاشة لكل دواء. في بعض الحالات ، تترسب البكتيريا أو الرواسب أو الأدوية إلى قاع البئر. هذه الظاهرة المعروفة باسم زائدة, يشار إليها بعدة آبار لها نفس حجم الحبيبات ولا تعتبر في الواقع نموا إيجابيا.

بعد ذلك ، يتم فحص صفائح H 10 و Blood Agar السبعة لتحديد تركيزات البكتيريا وتقييم النقاء. يجب ألا تظهر صفيحة أجار الدم أي نمو بعد 48 ساعة. يشير النمو على صفيحة أجار الدم إلى تلوث بالبكتيريا سريعة النمو.

إذا كان هناك نمو ، فيجب تكرار اختبار الميكروتيتر. يجب أن تحتوي لوحة النقاء السبعة H 10 على نمو كائن حي واحد. يجب أن يظهر السل من النوع EM برتقاليا وملونا ومتجعدا وخشنا إذا كان ملوثا ، يجب تكرار اختبار Microtiter من مزرعة نقية.

لتقييم تركيز البكتيريا ، عد المستعمرات على لوحة H 10 السبعة. ثم باستخدام الجدول الموجود في المستند المكتوب المصاحب ، احسب عدد المستعمرات. نمت المتفطرة السلية من عينة مريضة وتم تقييم مقاومة المضادات الحيوية كما هو موضح في هذا الفيديو في اللوحة الموضحة هنا ، يوجد 12 دواء مختلفا بتركيزات متزايدة بأعلى تركيزات في الأعلى وأقل تركيزات في الأسفل.

تمت الإشارة إلى الحد الأدنى من التركيز المثبط ، أو MIC للدواء من خلال أدنى تركيز للدواء لم يظهر أي نمو ومحاط بدائرة في الصورة الموضحة هنا باستخدام نقاط توقف موحدة أنشأها معهد المعايير السريرية والمختبرية. تشير البيانات المعروضة هنا إلى أن هذه السلالة من السل ستكون مقاومة لإيسيد وريفامبين. في المختبر ، تشير الميكروفونات العالية التي تظهر في العديد من الأدوية الأخرى ، بما في ذلك الأوين والموكسيفلوكساسين والستربتومايسين والريفابوتين إلى مقاومة سلالة السل الكهرومغناطيسي لهذه العوامل.

يجب استخدام نتائج التصنيع العسكري المتعدد من قبل أخصائي الأمراض المعدية من ذوي الخبرة في علاج السل لوضع خطة علاج فردية بمجرد إتقان هذه التقنية يستغرق حوالي 40 دقيقة لإعداد عزل واحد. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن هذا عامل ممرض في الجهاز التنفسي وبمجرد إنشاء الهباء الجوي ، بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد المتفطرة السلية ، واختبار الحساسية لمضادات الميكروبات باستخدام طريقة تخفيف المرق الدقيق. لا تنس أن العمل مع المتفطرة السلية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل حماية الجهاز التنفسي حيثما نكون مطلوبين.