موسوعة JoVE للتجارب
علم المناعة
0 مشاهدة • 2:55 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بتعليق الخلايا التائية وعالجها بفيروسات العدسات CAR التي تحمل جينا لمستقبلات المستضد الخيمري أو فيروسات العدسات CAR و CRISPR.
يحتويفيروس العدسات كريسبر على جينات لدليل الحمض النووي الريبي ونيوكلياز Cas9 بالإضافة إلى جين مقاوم للمضادات الحيوية.
يتفاعل كل من فيروسات العدسات CAR و CRISPR مع الخلايا التائية وتطلق الحمض النووي الريبي الخاص بها.
يتم نسخ هذه الحمض النووي الريبي بشكل عكسي وتحويلها إلى الحمض النووي المقابل ، والذي يندمج في الحمض النووي للخلية التائية.
يتيح ذلك تخليق بروتينات CAR وتوجيه الحمض النووي الريبي وبروتينات Cas9.
يشكل دليل الحمض النووي الريبي مركبا مع Cas9 ، والذي يتعرف على وجه التحديد على الجين المستهدف على الحمض النووي للخلية التائية ويرتبط به.
في هذه الأثناء ، يشق Cas9 الحمض النووي ، مما يخلق انفصالا مزدوجا تقطعت به السبل.
يتم إصلاح هذا الكسر عن طريق الانضمام النهائي غير المتماثل ، وهي آلية إصلاح معرضة للخطأ ، مما يؤدي إلى تعديل الجينات المستهدفة.
هذا يولد خلايا تائية معدلة وراثيا مع مستقبلات مستضد خيمرية.
عالج الخلايا بالمضادات الحيوية للقضاء على الخلايا التائية غير المعدلة وعزل الخلايا التائية المستضدة المستضدة وراثيا بشكل انتقائي.
لتعطيل عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والبلاعم ، استخدم دليل الحمض النووي الريبي ، كما هو موضح في المخطوطة. احتضان كواشف التعداء في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، أضفها إلى خلايا 293T التي وصلت إلى 70٪ إلى 90٪ من التقاء ، وقم بزراعة الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لإنتاج فيروس العدس.
في 24 و 48 ساعة ، قم بحصاد وتركيز المواد الطافية المحتوية على الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق في أنابيب الطرد المركزي الفائق سعة 50 مليلتر ، والتجميد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها في المستقبل. ثم ، في اليوم الأول ، أعد تعليق الخلايا التائية برفق لتفتيت الوريدات.
في مختبر BSL-2 plus المعتمد ، لتوليد الخلايا التائية CAR ، أضف فيروس عدسي CAR19 وفيروس العدسات CRISPR الذي يستهدف GM-CSF إلى الخلايا التائية المحفزة. في اليوم الثالث واليوم الخامس ، بالنسبة للخلايا التائية المعدلة بالعدسات الخالية من الوسم كريسبر التي تم نقلها بنجاح والتي تحمل مقاومة البيورومايسين ، عالج الخلايا التي تحتوي على بيرومايسين ثنائي هيدروكلوريد بتركيز 1 ميكروغرام من بورومايسين لكل مليلتر.