تحليل الصرفي ذبابة الفاكهة اليرقات المحيطية الانشعابيات عصبون حسي والمحاوير استخدام الفسيفساء الوراثية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور المورفولوجيا التفصيلية للعصبونات الشجيرية في يرقات ذبابة الفاكهة (drosophila). يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع الأجنة، وإبقائها لفترة زمنية محددة، وتوليد مستنسخات جينية موسومة ببروتين GFP من خلال تحفيز تعبير lipase بواسطة الصدمة الحرارية. وتتمثل الخطوة الثانية في اختيار اليرقات التي تحتوي على مستنسخات عصبونية فلورية والتقاط صورة لتفرعاتها الشجيرية (ABAs).

بعد تصوير الحمم، يتم تشريحها وتثبيتها وصبغها مناعياً حتى يمكن تثبيتها وتصور مورفولوجيا المرافئ الشجيرية والنهايات المحورية من خلال مجهر الفلورسنت المناعي البؤري. سأقوم اليوم بشرح بروتوكول للتحليل المورفولوجي للخلايا العصبية الحسية المحيطية السفلية والزوائد الشجيرية في sula باستخدام الوسم الجيني. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التطور العصبي، مثل ما هي البرامج الجينية التي تتحكم في الهوية العصبية، والشكل الفموي الشجيري، والتوصيلات الخارجية؟

ابدأ هذا البروتوكول بجمع الأجنة على أطباق عصير التفاح. يتم تطبيق الصدمة الحرارية في حمام مائي بدرجة حرارة 38 °C، وتختلف المدة حسب الوراثة الجينية للجنين وأحجام المستنسخات المطلوبة. في هذا البروتوكول، قم بتوليد مستنسخات markum من أجنة تحتوي على محرك عصبي من نوع pand dendritic arborization. قبل الصدمة الحرارية، احتفظ بأجنة العلامة عند درجة حرارة 25 °C، محاطة بأنسجة رطبة لمدة ساعتين.

قم بتجهيز أطباق التجميع للصدمة الحرارية بجعلها قابلة للغمر باستخدام أطباق فارغة وحشوة البارافين. بعد ذلك، قم بتعريض أجنة المؤشر للصدمة الحرارية لمدة ساعة واحدة لإنتاج مستعمرات صغيرة أو وسم عصبونات مفردة. ولزيادة عدد المستعمرات، استخدم صدمة حرارية ممتدة عن طريق الحضن لمدة 45 دقيقة في الحمام المائي، يليه 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم 30 دقيقة أخرى في الحمام المائي.

لإنتاج مستنسخات flipout، يتم جمع الأجنة لمدة 24 ساعة متواصلة. يستخدم هذا البروتوكول محركاً محدداً من الفئة الرابعة. تُعرض أجنة flipout لصدمة حرارية لمدة ساعة واحدة بعد الصدمة الحرارية.

ضع أطباق التجميع في طبق بتري بقطر 10 سنتيمتر محاطاً بمناديل مبللة ومادة استنبات. تُحفظ الأجنة عند درجة حرارة 25 درجة Celsius أثناء عملية استنبات الأجنة، مع مراقبة ومعاد تزويد عجينة الخميرة حسب الحاجة، وذلك لأن التغذية تؤثر بشكل حاسم على التطور العصبي.

يتم الحفاظ على المزرعة حتى يمكن جمع يرقات الطور الثالث المتجولة، ثم تُغسل يرقات الطور الثالث سريعاً وبلطف بماء الصنبور وتُنقل إلى طبق أغار. الآن، يتم فحص اليرقات باستخدام مجهر تشريحي فلوري قوي وملاقط حشرات. يتم تحديد اليرقات التي تحتوي على عصبونات موجبة لـ GFP في جدار الجسم ونقلها إلى شريحة مقعرة تحتوي على قطرة من glycerol بتركيز 80%.

ضع غطاء الشريحة فوق الشريحة لتثبيت اليرقة. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين اليرقة وغطاء الشريحة. استخدم المجهر البؤري القياسي لتصور العصبونات المستهدفة من خلال كيوتيكل اليرقة.

لتغيير موضع اليرقة من أجل تحسين زاوية الرؤية، اضغط برفق على غطاء الشريحة لتحريك اليرقة. ابدأ هذا البروتوكول بنقل يرقة إلى لوحة حماية SIL باستخدام ملقط الحشرات، ثم قم بتثبيتها بدبابيس عند الطرفين الأمامي والخلفي.

ثم أضف محلول HL 3.1 المنظم الخالي من الكالسيوم. الآن، قم بالقص في منتصف كلا الطرفين من اليرقة بشكل عمودي على المحور الأمامي الخلفي. ثم قص على طول الخط المتوسط بين القصبتين الهوائيتين.

اقطع بعناية كل وصلة قصيبة فردية مرتبطة بجدار الجسم قبل إزالة الأمعاء برفق. يضمن ذلك بقاء الأعصاب القطعية الممتدة بين الجهاز العصبي المحيطي (PNS) والجهاز العصبي المركزي (CNS) سليمة. وبينما لا تزال اليرقة مثبتة بالدبابيس على لوحة حماية الخلية، قم بتثبيتها في 4%Para formaldehyde في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على هزاز دوار هادئ، مع الحرص على إتمام كل عملية تشريح في أقل من خمس دقائق.

وخلاف ذلك، ستبدأ نواتج الخلايا العصبية الشجيرية المفوضة في التحلل. بعد التثبيت، قم بإزالة الأنسجة اليرقية الزائدة. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 10 دقائق في كل غسلة.

بعد عمليات الغسل، يتم تحضين اليرقات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في محلول الحجب مع الرج الخفيف. وبعد اكتمال عملية الحجب، يتم استبدال محلول الحجب بمحلول الأجسام المضادة الأولية. توضع العينة في حاوية بلاستيكية صغيرة محاطة بمناديل مبللة وتُحضن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، يستمر التحضين لمدة ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اغسل شريحة الحمم ست مرات في PBST لمدة 10 دقائق لكل غسلة. الآن، أضف الأجسام المضادة الثانوية وضع الشرائح في حاوية معتمة لمنع التبييض الضوئي للمادة الفلورية. قم بتحضين الشرائح إما لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل في درجة حرارة 4 °C، يتبع ذلك ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

أخيراً، اغسل الشرائح ست مرات في محلول PBST لمدة 10 دقائق لكل غسلة. تصبح الأنسجة بعد ذلك جاهزة للتثبيت. ولتصوير نهايات المحاور العصبية، قم ببساطة بتثبيت شريحة اليرقة بحيث يكون جانب القشيرة للأسفل في محلول glycerol بتركيز 80% في شريحة غائرة.

للحصول على صور أكثر وضوحاً للشجيرات العصبية، قم بإعداد تثبيت دائم باستخدام شرائح غطاء مطلية بـ PLL. لترميز شرائح الغطاء، استخدم مقداراً معيناً من PLL. أضف إليه ما يكفي من الماء المقطر مرتين ليصل الحجم إلى 10 milliliters، ثم أضف 20 microliters من Kodak photo flow.

اغمر شرائح التغطية لمدة 30 دقيقة في محلول PLL واتركها تجف في الهواء بعد إخراجها. ثم اشطفها سريعاً بالماء واتركها تجف في الهواء مرة أخرى.

كرر هذه العملية مرتين. وبدءاً من حمام PLL، ستظل الشرائح الغطائية المعالجة صالحة لمدة شهر تقريباً. الآن، قم بتثبيت قطعة من عضلة يرقة مشرحة بحيث يكون جانب العضلة للأسفل في قطرة من PBS على شريحة غطائية مطلية بـ PLL.

ستلتصق الشريحة بسرعة بغطاء الشريحة الزجاجية باستخدام قطعة من ورق المناديل. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل، ومع ذلك، لا تسمح لها بالجفاف تماماً. بعد ذلك، قم بتجفيف شرائح اليرقات من الماء عبر سلسلة من حمامات الإيثانول لمدة 10 دقائق، بدءاً من ethanol 35%، يليه ethanol 50% ثم 70% ثم 95% ثم 100% وأخيراً حمام ثانٍ من ethanol 100%.

اتبع حمامات الإيثانول بحمامين أو ثلاثة حمامات من الزيلين لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد ذلك، ضع قطرة من DPX على شريحة نظيفة ثم ضع غطاء الشريحة بعناية فوق الـ DPX، بحيث يكون وجهه لأسفل. احتفظ بالشريحة في مكان مظلم وانتظر يوماً واحداً حتى يتماسك الـ DPX.

قبل تصوير النسيج باستخدام المجهر البؤري والمجهر الحي (in vivo)، يمكن التقاط صور مثل هذه. هذه الشجرة الكاملة لنيورون من الفئة الرابعة ذي تفرعات شجيرية. وهذه صورة مقربة لشجرة شجيرية من نيورون من الفئة الثالثة تم وسمه بتقنية IHC وتثبيته بشكل صحيح للحفاظ على المورفولوجيا.

يوضح الشكل المدرج التحلل الذي يمكن أن يحدث بعد عملية تشريح وتثبيت غير ناجحة. وتظهر هذه الصورة المتراكبة نهاية محور عصبي واحد من الفئة الرابعة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). تم وسم المحور العصبي باستخدام anti GFP باللون الأخضر، وجميع نهايات المحاور من الفئة الرابعة بصبغة مشتركة باستخدام anti CD two باللون الأرجواني.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تشريح العينات وتثبيتها بسرعة عن طريق تتبع المحاور العصبية من المحيط وصولاً إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS). ومن المفيد أن تضع في اعتبارك أن عصبونات الجهاز العصبي الطرفي (PNS) في كل جزء من الجسم ستسقط بشكل مجزأ على الجزء المعرفي من شفرة العصب البطني. كما أنه إذا كنت ترغب فقط في تصور الزوائد الشجرية، فقم بإزالة الجهاز العصبي المركزي (CNAs) أثناء التشريح، ويمكن إجراء التلوين في أنابيب بدلاً من الأطباق.

عند تثبيت هذه الشرائح للتصوير الشجيري، قم أولاً بقطع الرأس باستخدام خطافات الفم والجزء الخلفي باستخدام الملاقط. وذلك لضمان تحضير دقيق.