تحديد اختبار تأثير هرمون النمو على الخلايا العصبية كيسببتين باستخدام خلية كاملة التصحيح المشبك

قم بتأمين شريحة ما تحت المهاد من الفأر المعدلة وراثيا في غرفة تسجيل مملوءة ب aCSF.

الشريحة على خلايا عصبية كيسببتين تعبر عن بروتين الاندماج الفلوري ، وهي ضرورية لتنظيم الجهاز التناسلي.

قم بتجميع ماصة دقيقة تشتمل على قطب تسجيل في محلول داخلي.

تحديد موقع خلية عصبية كيسببتين الفلورية مجهريا.

اضغط إيجابيا على الماصة ودفعها نحو الخلية العصبية المستهدفة. عند التلامس ، يخلق الضغط فجوة على الغشاء العصبي.

استخدم ضغطا سلبيا قصيرا ، لتشكيل مانع تسرب عالي المقاومة بين الماصة الدقيقة والغشاء.

اضبط جهد الإمساك على إمكانات الراحة الفسيولوجية للخلية العصبية لإجراء قياسات دقيقة.

قم بتطبيق نبضات ضغط سلبي قصيرة لكسر الغشاء ، وإنشاء تكوين خلية كاملة.

تأكد من صلاحية الخلايا العصبية من خلال مراقبة المعلمات.

إدخال اختبار هرمون النمو, تحريك مسارات الإشارات والحث على تغييرات في إمكانات غشاء الخلايا العصبية.

قياس التغيرات في الغشاء إمكانات لتحديد تأثير هرمون النمو المثبط على النشاط العصبي.

انقل شريحة من الدماغ ذات الاهتمام، واحدة تلو الأخرى، إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة نقل الأكريليك. أمسك الشريحة بمرساة شريحة حتى لا تتحرك أثناء نضح aCSF. ضع الشريحة في منتصف غرفة التسجيل باستخدام العدسة الموضوعية منخفضة الطاقة في المجهر الغاطس 10x أو 20x.

يعد موضع الشريحة أمرا بالغ الأهمية للسماح برؤية جيدة للمنطقة المطلوبة تحت المجهر وللوصول المثالي إلى الماصة الدقيقة المسجلة. بعد تحديد موقع المنطقة التي تهمك ، قم بتبديل العدسة الموضوعية إلى العدسة عالية الطاقة ، 63x ، وركز على مستوى الأنسجة ، مع ملاحظة البروتين الفلوري الداخلي وأشكال الخلايا في المنطقة المستهدفة لتحديد موقع خلايا كيسببتين على سطح شريحة الدماغ.

عند تحديد موقع خلية مستهدفة محتملة ، قم بتمييزها على شاشة الكمبيوتر باستخدام مؤشر الماوس أو عن طريق رسم تنسيق مثل مربع فوق منطقة الاهتمام. تساعد شاشة الكمبيوتر المميزة على توجيه موضع الماصة الدقيقة للتسجيل إلى الخلية. بعد تحديد الموقع الدقيق للخلية المستهدفة ، ارفع الهدف ، وأدخل الماصة الدقيقة المسجلة المملوءة بالمحلول الداخلي في حامل القطب الكهربائي ، مما يضمن اتصال المحلول الداخلي بالقطب الفضي.

استخدم ضغطا إيجابيا قبل غمر الماصة الدقيقة في محلول aCSF باستخدام حقنة مملوءة بالهواء من 1 إلى 3 ملليلتر متصلة بحامل الماصة الدقيقة من خلال أنبوب بولي إيثيلين لمنع الحطام من دخول الماصة الدقيقة. باستخدام المعالج الدقيق ، قم بتوجيه الماصة الدقيقة أسفل مركز الهدف. حرك أزرار المعالجة الدقيقة لتوجيه المحور x وy وz للماصة الدقيقة نحو الخلية محل الاهتمام.

اضبط التركيز البؤري لرؤية طرف الماصة الدقيقة واقرب التركيز البؤري، ولكن ليس قريبا جدا من الشريحة. قلل سرعة المعالج الدقيق ، وقم بخفض الماصة الدقيقة ببطء إلى مستوى التركيز البؤري ، مما يضمن عدم اختراق طرف الماصة الدقيقة للشريحة فجأة ، ولكنه ينزل ببطء حتى يلامس سطح الخلية أو المنطقة المستهدفة.

تطبيق ضغط إيجابي خفيف باستخدام المحقنة المملوءة بالهواء من 1 إلى 3 ملليلتر لإزالة أي حطام من مسار الاقتراب ، حرك المعالج الدقيق ببطء على المحور x ، y ، z لتقريب طرف الماصة الدقيقة ولمس الخلية المستهدفة ، مما يتسبب في حدوث غمازة بسبب الضغط المطبق. بعد إنشاء الغمازة ، بمساعدة وضع مشبك الجهد على البرنامج ، قم بتطبيق شفط قصير ضعيف عن طريق الفم لمدة 1 إلى 2 ثانية من خلال الأنبوب المتصل بحامل الماصة الدقيقة لتوليد الختم بين الماصة الدقيقة إلى الخلية.

إذا ظل الختم مستقرا ميكانيكيا دون تدخل في الضوضاء لمدة دقيقة تقريبا ، فاضبط جهد التثبيت على أقرب إمكانات الراحة الفسيولوجية للخلية محل الاهتمام. بالنسبة للخلايا العصبية تحت المهاد كيسببتين ، يوصى بناقص 50 مللي فولت. بعد ذلك ، قم بتطبيق شفط قصير عن طريق الفم لكسر غشاء البلازما عند طرف الماصة الدقيقة المختوم الموضوع في الخلية بحيث لا يسد الغشاء الممزق الماصة الدقيقة ، أو يجذب جزءا كبيرا من الغشاء ، أو الخلية.

يمكن تحقيق تكوين مناسب للخلية الكاملة من خلال إجراء الشفط بقوة كافية. تحقق من دليل إعدادات النظام المستخدم. بعد كسر غشاء الخلية ، قم بتمكين خيار الخلية الكاملة في وضع مشبك الجهد ، وانقر فوق الأمر التلقائي الذي يشير إلى علامة التبويب الخلية الكاملة.

بعد ذلك ، تحقق من معلمات صلاحية الخلية في البرنامج كما هو موضح في المخطوطة النصية. راقب مقاومة السلسلة وسعة الحالة المستقرة للخلايا أثناء التجارب. بمجرد تحقيق تكوين الخلية بأكملها بشكل صحيح ، قم بقياس التيارات المشبكية في وضع مشبك الجهد. سجل التغييرات في إمكانات غشاء الراحة والتغيرات المحتملة المستحثة في غشاء الراحة في وضع المشبك الحالي.