اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختيار طفيليات plasmodium, fpar، والطفيليات القادرة على الارتباط بالخلايا البطانية للدماغ البشري. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضين مستنبت من plasmodium, fpar، والطفيليات، والذي يحتوي على خليط من خلايا دم حمراء مصابة وغير مصابة، مع طبقة من الخلايا البطانية للدماغ البشري؛ وتتمثل الخطوة التالية في غسل خلايا الدم الحمراء غير المصابة وغير المرتبطة عن طريق الغسل عدة مرات باستخدام وسط الزرع. بعد ذلك، يتم إضافة خلايا دم حمراء طازجة للسماح بمزيد من نمو التجمعات الطفيلية.

تتمثل الخطوة النهائية بعد بضعة أسابيع في تكرار عملية الاختيار الشاملة بمجرد الوصول إلى عدد كافٍ من الطفيليات. وفي النهاية، يُستخدم الفحص المجهري لإظهار كمية كبيرة من الطفيليات المرتبطة بـ HBE five i. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الملاريا الدماغية، مثل تحديد ربيطات الطفيليات أو جزيئات مستقبلات المضيف المشاركة في عملية التحمل الخلوي.

قم بتحضير خلايا الدم الحمراء البشرية من دم كامل من الفصيلة O موجبة، وذلك عن طريق فصل خلايا الدم الحمراء عن خلايا الدم البيضاء عبر تمريرها من خلال مرشح لإزالة الكريات البيضاء. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 1000 G لمدة 10 دقائق، ثم أعد تعليق الراسب باستخدام وسط PMI Incomplete.

كرر خطوة الغسل هذه مرة أخرى، ثم أعد تعليق الراسب. وفي وسط PMI غير الكامل بنسبة 50% hematocrit، تُخزن خلايا الدم الحمراء عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة أسبوع. قم بزراعة خلايا الدم الحمراء المصابة بـ Odium Valspar.

بواسطة وسط RPMI الكامل بنسبة 2% hematocrit، مع التحضين عند 37 درجة مئوية مع 3% carbon dioxide و1% oxygen و96% nitrogen يومياً. قم بإعداد لطاخة جيم (gem smear) لتقييم المرحلة التطورية للطفيليات. استبدل الوسط يومياً عن طريق تدوير المزرعة عند 500 G لمدة خمس دقائق.

يتم سحب السائل الطافي وإضافة وسط RPMI كامل جديد مرة واحدة تقريبًا في الأسبوع. يتم مزامنة الطفيليات عن طريق المعالجة بسوربيت مائي بتركيز 5%D. يمكن إجراء اختبار الانتخاب في اليوم التالي لظهور مزرعة في مرحلة الحلقة بنسبة طفيليات لا تقل عن 5% إلى 10%.

بالإضافة إلى ذلك، يلزم توفير كمية كافية من مزرعة الطفيليات لتكوين حجم 30 µL من الخلايا لكل طبق بقطر 60 mm من خلايا hbe five eye. قم بتجهيز طبق زراعة أنسجة بقطر 60 mm لاستقبال الخط الخلوي للخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري أو H back fivei عن طريق إضافة 2 µg/cm² من الفيبرونيكتين والمحلول الملحي المعقم إلى الطبق.

يُحضن الطبق عند 37 درجة Celsius لمدة تتراوح من 5 إلى 20 دقيقة، ثم يُشفط محلول الفيبرونيكتين. بعد ذلك، تُجمع خلايا HBE five I من قارورة أنسجة بمساحة 25 سنتيمتر مربع عن طريق التأين والطرد المركزي، ويُعلق راسب الخلايا في 10 ملليلتر من وسط DMEM الكامل. ثم يُضاف 1.5 ملليلتر من معلق الخلايا هذا إلى طبق زراعة الأنسجة المعالج بالفيبرونيكتين ويُحضن عند 37 درجة Celsius و5% carbon dioxide لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى تصل المزرعة إلى 50 إلى 100% من درجة التلاقي (confluency)، وتصبح مزارع الطفيليات جاهزة للاختبار الخلوي في يوم المقايسة.

يجب أن تكون مزرعة HBE five I بنسبة تلاقي تتراوح بين 50 إلى 100%. بينما يجب أن تكون مزرعة الطفيليات في مرحلة trophozoites المصبوغة مع وجود 5 إلى 10% من الطفيليات على الأقل و2% hematocrit. أولاً، اسحب 1.5 milliliters من مزرعة الطفيليات باستخدام الماصة من قارورة المزرعة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter.

قم بطرد المزرعة مركزياً عند 500 G لمدة خمس دقائق، ثم أعد تعليقها في 10 milliliters من وسط DMEM غير كامل ودافئ تم تحضيره حديثاً. كرر خطوة الغسل هذه مرة ثانية بعد اكتمال عملية الطرد المركزي النهائية.

قم بتجميع وسط DMEM غير المكمل، وأعد تعليق الراسب بحجم 30 µL في 1.5 mL من وسط DMEM غير المكمل، المدعم بـ 1% BSA. بعد ذلك، استخرج طبق hvac.Five بقطر 60 مليمتر.

قم بسحب الوسط الزرعي من خلايا العين واغسلها مرتين باستخدام ثلاثة ملليلتر من DMEM، وهو وسط غير كامل. أضف محلول الطفيليات إلى طبق خلايا HPE-5 العينية، ثم حضنها في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 75 دقيقة إجمالاً.

أثناء فترة تحضين الإنعاش، قم بتعليق الطفيليات عن طريق هز وتدوير الطبق بلطف بعد انتهاء التحضين. اغسل الطبق خمس مرات عن طريق شفط الوسط باستخدام ماصة بلاستيكية، مع إضافة 3 mL من وسط DMEM غير المكمل الدافئ، ثم قم بهز الطبق بلطف بعد الغسلة الأخيرة، وافحص الطبق تحت مجهر مقلوب. إذا كانت هناك العديد من خلايا الدم الحمراء غير المصابة لا تزال مرئية، كرر إجراء الغسل كما هو موضح أعلاه لإزالتها.

بعد سحب الوسط من الطبق، قم بإعادة تعليق 40 µL من حجم الخلايا المكدسة من كريات الدم الحمراء الطازجة في وسط RPMI كامل مدفأ، ثم أضف معلق الخلايا إلى الطبق. ضع الطبق في حجرة تحضين محكمة الإغلاق. بعد ذلك، قم بتعريض الطبق لغازات مكونة من 3% carbon dioxide و 1% oxygen و 96% nitrogen لمدة ثلاث دقائق.

ثم ضع الحجرة في حاضنة عند 37 درجة مئوية طوال الليل. خلال هذه الحضانة، تنفجر الطفيليات في مرحلة الم分裂 (schizont) وتعيد الأتروفوزويتات (merozoites) غزو خلايا الدم الحمراء. وفي اليوم التالي، يتم جمع الطفيليات في مرحلة الحلقة عن طريق الغسل.

باستخدام وسط RPMI غير المكمل بنفس الطريقة السابقة، ولكن مع زيادة قوة السحب بالماصة للوسط وهز الصفيحة. احتفظ بجميع الأوساط المستخدمة، والتي ستحتوي على خلايا الدم الحمراء المعاد تعليقها، في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. افحص الصفيحة تحت مجهر مقلوب للتأكد من إزالة جميع خلايا الدم الحمراء من جهاز طرد مركزي للأطباق.

يتم التخلص من السائل الطافي في الأنبوب الذي يحتوي على الوسط من الطبق المغسول لترسيب الطفيليات، ثم يُعاد تعليق الراسب في 5 mL من وسط RPMI الكامل، ويوضع المزيج في دورق مربع سعة 25 cm² للاستزراع. تُستزرع الطفيليات لمدة تتراوح من أسبوعين إلى أربعة أسابيع حتى يتم الحصول على مادة كافية لإجراء جولة جديدة من الاختيار.

تظهر طفيليات HB three غير المختارة مستوى منخفضاً من الارتباط بخلايا hbe five eye. تُظهر هذه الصورة خلايا hbe five eye مثبتة باستخدام 2% glutaraldehyde ومصبوغة بـ giemsa، وتمت رؤيتها تحت المجهر بتكبير 1000 مرة؛ حيث التُقطت الصور بعد غسل كرات الدم الحمراء غير المصابة وكرات الدم الحمراء المصابة غير المرتبطة. وبعد كل جولة اختيار، يزداد ارتباط الطفيليات بالخلايا البطانية، ويمكن تكرار عمليات الاختيار على فترات زمنية أقصر بعد خمس جولات من الاختيار.

يتم الحصول على مجموعات من الطفيليات ذات القدرة العالية على الارتباط كما هو موضح هنا باستخدام طفيليات HB three HBE. يوضح هذا الجدول ملخصاً لسلالات plasmodium alspar التي تم اختيارها بنجاح للارتباط بـ HE five. ألاحظ أن HB three قد تم اختياره أيضاً على HE five I المنشط بواسطة TNF بعد خمس جولات من الاختيار.

لم تُظهر سلالة DD two أي زيادة في الارتباط بـ HBE five I مقارنة بسلالة DD two غير المختارة. تُظهر هذه الصورة بتكبير 400 مرة ارتباط طفيليات plasmodium alspar HB three بخلايا HD MEK البطانية الجلدية قبل عملية الاختيار. وهنا، يظهر ارتباط طفيليات plasmodium alspar HB three بنفس الخط الخلوي للخلايا البطانية الجلدية بعد أربع جولات من الاختيار.

يوضح هذا الشكل ارتباط طفيليات Plasmodium spar HB3 بالخلايا البطانية الرئوية HP ME قبل عملية الانتقاء. والآن نلاحظ أن ارتباط طفيليات Plasmodium spar HB3 بخلايا H HP ME قد ازداد بعد أربع جولات من الانتقاء. وعلى الرغم من أن الوسط الزرعي لخلايا hd e وC وH HP EC يختلف قليلاً، إلا أن البروتوكول المستخدم للانتقاء كان متطابقاً مع بروتوكول hbe five I. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق مثل R-T-P-C-R أو التحليل الدقيق (micro analysis) للإجابة على تساؤلات إضافية، مثل توصيف نسخ مستضد السطح المتغير في الطفيليات غير المنتقاة والمنتقاة.