غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير
نوفمبر 13, 2011
تعبير الحمض النووي الريبي لمناطق دماغ الفأر المنفصلة استراتيجية دقيقة وقابلة للتكرار لجمع الأنسجة. يتم وصف البروتوكول الذي يستخدم كلا من قسم الدماغ الإكليلي والتشريح المجهري بمساعدة الأنسجة هنا يؤكد عائد وجودة إجمالي الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه من العينات الناتجة فائدة الطريقة الموضحة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع إجمالي الحمض النووي الريبي من نوى الدماغ السرية بطريقة قابلة للتكرار ومتسقة وفعالة من حيث التكلفة وخالية من الحمض النووي الريبي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد بيئة عمل خالية من RN أولا وإزالة الدماغ بالكامل من فأر مقطوع الرأس. بعد ذلك ، يتم استخدام مفرمة الأنسجة التي تعمل بالميكرومتر لقطع أقسام الأنسجة التسلسلية ذات الحجم المنتظم.
ثم يتم تشريح مناطق الدماغ ذات الأهمية الدقيقة باستخدام نواة أنسجة ذات قطر محدد مع الحفاظ على الأنسجة في بيئة متوسطة خالية من الحمض النووي الريبي. أخيرا ، يتم عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن نوى الدماغ المستأسولة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر إنتاجية وجودة إجمالية كافية للحمض النووي الريبي لإعداد مكتبة CDNA النهائية وتوصيف النسخ من خلال المقايسات الطيفية الضوئية أو المقايسات المترية الفلورية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل استئصال منطقة الدماغ التشريحي الإجمالي أو المجهري بالليزر ، هي أنه يمكن جمع مناطق دماغية منفصلة متعددة ذات أهمية من دماغ الفأر الفردي بطريقة قابلة للتكرار وتكلفة كافية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل ما إذا كانت ملفات تعريف التعبير عن النسخ المميزة داخل مناطق الدماغ المرتبطة بعدم وجود دوائر عصبية قد تكون مرتبطة ببعض السمات السلوكية أو الاستجابات البيئية أو حالة المرض. للتحضير للتشريح المجهري ، استكمل 100 مل من محلول الملح المتوازن من إيرل أو EBSS ب 0.44 جرام من بيكربونات الصوديوم و 0.884 جرام من الجلوكوز.
عالج EBSS ب 0.1 مل من DEPC في زجاجة أو قارورة قابلة للتعقيم بسطح لولبي لمدة 12 ساعة على الأقل. عند 37 درجة مئوية. ضع ماصات زجاجية بحجم خمسة وثلاثة أرباع بوصات في دورق زجاجي سعة لتر واحد وضع فرش الفنانين ذات الشعيرات المتجهة لأعلى في أسطوانة زجاجية متدرجة سعة 100 مل.
أضف محلول مياه معالج كاف من DEPC لتغطية الماصات والفرش. قم بتغطية الدورق والأسطوانة المتدرجة بورق الألمنيوم واحتضانه لمدة 12 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية بعد 12 ساعة من الحضانة مع DEPC ، والحرارة ، وجميع المواد المعالجة DEPC إلى درجة حرارة أعلى من 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. برد. EBSS في درجة حرارة الغرفة قبل التخزين عند أربع درجات مئوية.
اسكب DD H2O من الدورق والأسطوانة المتدرجة واستمر في احتضانها عند درجة حرارة تزيد عن 100 درجة مئوية حتى تجف المواد. أخرجيها من الحاضنة ، واتركيها تبرد في درجة حرارة الغرفة واحفظيها لاستخدامها لاحقا. في يوم التجربة ، قم بمعالجة جميع أسطح العمل لإزالة تلوث الحمض النووي الريبي والحفاظ على EBSS في حمام مائي محدد عند 40 درجة مئوية للتخزين المؤقت والأكسجين.
يتسلل EBSS إليه بنسبة 5٪ CO2 و 95٪ أكسجين عن طريق وضع أنابيب الغاز في ماصة المراعي الخالية من الحمض النووي الريبي. وإدخال الماصة في غطاء EBSS لفتحة حاوية EBSS. قم بإعداد قطاعة الأنسجة للتقسيم التسلسلي لأنسجة الدماغ.
عالج الأسطح العلوية والسفلية لتقطيع الأنسجة. لإزالة تلوث الحمض النووي الريبي ، قم بإرفاق قطعة مستطيلة من واتمان رقم أربعة ، ورق الترشيح على سطح زجاج شبكي لمفرمة الأنسجة. قم بتوصيل شفرة حلاقة ذات حدين بذراع المروحية.
اضبط الميكرومتر على الصفر واضبط الحد الأدنى لارتفاع ذراع المروحية للسماح لشفرة الحلاقة بقص ورق الترشيح، ولكن ليس لوحة زجاج شبكي. اجمع جميع المواد الإضافية اللازمة للتشريح الدقيق ، بما في ذلك أطباق زراعة الخلايا الخالية من الحمض النووي الريبي 60 × 15 ملم ، وأطراف ماصة صغيرة خالية من الحمض النووي الريبي 200 ميكرولتر ، والمقص المنحني ، والثلج الجاف ، وأنابيب لجمع الأنسجة. ضع الأنابيب على ثلج جاف بعد قطع رأس الفأر باستخدام مقصلة القوارض وإزالة الدماغ بالكامل مع سلامة كل من الدماغ الخلفي والأعصاب البصرية.
ضع الدماغ في الجزء العلوي من طبق ثقافة الخلايا الحرة من الحمض النووي الريبي 60 × 15 ملم. ثم انقله إلى سطح عمل أخذ عينات الأنسجة. استخدم ماصة خالية من الحمض النووي الريبي لترطيب ورق الترشيح المتصل بمفرمة المناديل باستخدام EBSS بشكل متحفظ.
بلل أنسجة المخ باستخدام EBSS. انقل الدماغ إلى مفرمة الأنسجة وضعه مع وضع السطح البطني على ورق الترشيح. خط الوسط العمودي على شفرة المروحية والحافة المنقارية للدماغ المتاخمة للشفرة.
استخدم فرشاة الفنان المعالجة A-D-E-P-C لتثبيت الدماغ ثابتا عن طريق الضغط برفق على السطح الظهري للدماغ أثناء تثبيت الدماغ. ارفع ذراع حامل الشفرة حوالي أربعة إلى خمسة سنتيمترات فوق سطح الأنسجة الظهرية واحتفظ به في هذا الوضع. قم بإزالة الفرشاة من سطح الدماغ واطلب 750 ميكرومتر.
باستخدام الميكرومتر. اسمح للذراع بالسقوط ، وتقطيع الأنسجة وإنشاء قسم إكليلي 750 ميكرومتر بينما تظل شفرة المروحية ثابتة. استخدم حركة دحرجة بفرشاة الفنان لتمرير قسم المناديل برفق بعيدا عن سطح الشفرة.
ضع قسم الأنسجة على الفور في EBSS المؤكسج في طبق بتري. هذه الشريحة جاهزة الآن للتشريح الدقيق. كرر إجراء التقطيع حتى يتم الحصول على أقسام الدماغ التسلسلية عبر مستوى الترميز الروست بأكمله لإجراء التشريح الدقيق.
أولا ، تحقق من الإضاءة للتأكد من عدم إعاقة إضاءة العينة. اضبط موضع وتدفق مزيج O2 CO2 للحفاظ على بيئة مؤكسجة مخزنة للأنسجة. أثناء الإجراء ، حدد قسم الدماغ الإكليلي الذي يتضمن منطقة الاهتمام وباستخدام فرشاة الفنان ، قم بتوجيهه بشكل مسطح في قاع طبق بتري.
حدد قلب الأنسجة بالقطر المناسب. أمسك قسم الأنسجة الإكليلية في مكانه بفرشاة الفنان وارفع طرف القطع للب الأنسجة لأسفل فوق سطح قسم الأنسجة. أثناء الضغط ، اضغط على طرف قلب الأنسجة من خلال قسم الأنسجة ولأسفل بقوة على قاع طبق بتري.
استخدم حركة دائرية متدحرجة للتأكد من أن منطقة الاهتمام قد تم فصلها عن الأنسجة المحيطة. ارفع قلب الأنسجة بعناية بعيدا عن قسم الأنسجة وحرر الثقب الدقيق للسماح له بالطفو في EBSS باستخدام فرشاة فنان. قم على الفور بإيداع الثقب الصغير للأنسجة في أنبوب تخزين مستقر بدرجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر محفوظ على الثلج الجاف.
يجب أن تلتصق الأنسجة بسهولة بجانب الأنبوب. أعد عينة الميكروس التي تحتوي على أنبوب إلى الثلج الجاف. كرر هذا التشريح المجهري لكل منطقة من مناطق الدماغ ذات الأهمية.
بمجرد اكتمال التشريح المجهري ، قم بتسجيل الملصق أو الرموز الشريطية المعنية لكل عينة تحتوي على أنبوب. ضع عينات الأنسجة في ثلاجة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى استخراج الحمض النووي الريبي لاستخراج الحمض النووي الريبي من عينات الأنسجة. أولا ، قم بإعداد مساحة عمل خالية من الحمض النووي الريبي.
اصنع كمية كافية من مزيج الخرز المغناطيسي ومحلول ربط التحلل كما هو موضح في دليل مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الإجمالي. قم بإزالة عينات المناديل من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر وضع الأنابيب مباشرة على الثلج الجاف. أضف 100 ميكرولتر من محلول ربط التحلل إلى أنبوب العينة.
قم بتوصيل مدقة بحجم أنبوب 0.5 ملليلتر خالية من النوكلياز بخلاط الحبيبات وقم بتجانس الأنسجة باستخدام طرف ماصة خال من نوكلياز منخفض الاحتجاز. انقل العينة المتجانسة إلى بئر على صفيحة مستديرة لزراعة أنسجة البئر 96 باستخدام نفس النوع من الأطراف على الفور. أضف 60 ميكرولترا من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ إلى العينة.
أضف 20 ميكرولترا من مزيج الخرز إلى العينة واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث إلى أربع مرات. اتبع خطوات بروتوكول مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي لإكمال استخراج الحمض النووي الريبي الكلي. أخيرا ، قم بقياس نقاء وتركيز إجمالي الحمض النووي الريبي الناتج في هذا الجدول
.عينات الحمض النووي الريبي الملمح إليها ب 30 ميكرولتر من التطور قدمت المخزن المؤقت ما يكفي من الحمض النووي الريبي الكلي للاستخدام مع منتجات تحضير CD NA المتاحة تجاريا لتطبيقات تسلسل الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عائد الحمض النووي الريبي ونسبتين من 60 إلى نسبتين 80 هي قيم مفردة تم الحصول عليها من عينات التشريح الدقيق المعنية لإثبات القراءات التي تم الحصول عليها من كل منطقة من مناطق الدماغ وتؤكد نقاء العينة العالي بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثماني إلى 10 دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل مخاطر تلوث الحمض النووي الريبي لأسطح العمل أو عينات الأنسجة باستخدام مواد خالية من الحمض النووي الريبي أو معالجة dsy فقط.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تصف هذه المقالة بروتوكولاً لتحديد ملامح التعبير عن الحمض النووي الريبي في مناطق دماغ الفأر المنفصلة، مع التركيز على استراتيجية جمع الأنسجة الدقيقة والقابلة للتكرار.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء الجزيئي
- تحديد ملامح الحمض النووي الريبي
الخلفية
- تحديد ملامح التعبير عن الحمض النووي الريبي ضروري لفهم وظائف الدماغ.
- تتطلب نوى الدماغ المنفصلة تشريحًا دقيقًا لتحليل دقيق.
- من الضروري الحفاظ على بيئة خالية من RNase لسلامة الحمض النووي الريبي.
- تفتقر الطرق السابقة إلى التناسق والتكرار.
هدف الدراسة
- لإنشاء بروتوكول موثوق لاستخراج الحمض النووي الريبي من مناطق دماغ الفأر.
- لضمان عائد وعالي الجودة للحمض النووي الريبي للتطبيقات اللاحقة.
- تسهيل تحديد ملامح النسخ من خلال تحسين طرق جمع الأنسجة.
الطرق المستخدمة
- إعداد بيئة عمل خالية من RNase.
- فصل الرأس وإزالة الدماغ بالكامل من الفأر.
- تقطيع منتظم للأنسجة الدماغية باستخدام مقطوعة أنسجة تعمل بالميكرومتر.
- تشريح دقيق لمناطق الدماغ المستهدفة باستخدام قلب نسيجي في وسط خالٍ من الحمض النووي الريبي.
النتائج الرئيسية
- تم الحصول على عائد عالٍ للحمض النووي الريبي الكلي من نوى الدماغ المقطعة.
- تم تأكيد أن جودة الحمض النووي الريبي مناسبة لتحضير مكتبة الحمض النووي الريبي التكميلية.
- تدعم النتائج فائدة الطريقة في تحديد ملامح النسخ.
- أظهرت الاختبارات أن جودة الحمض النووي الريبي كافية للتطبيقات اللاحقة.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول الموضح نهجًا موثوقًا لاستخراج الحمض النووي الريبي.
- يعزز التناسق والجودة لعينات الحمض النووي الريبي من مناطق دماغ الفأر.
- هذه الطريقة مفيدة للبحوث المستقبلية في علم الأعصاب التي تتضمن تحليل الحمض النووي الريبي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This microdissection approach enables reproducible, high-yield total RNA isolation from discrete mouse brain regions, addressing a key bottleneck in neuroscience target validation where low RNA yields from laser capture microscopy hinder transcriptome profiling. By providing consistent RNA quality suitable for next-generation sequencing, the method supports mechanistic de-risking of CNS targets and improves predictive confidence in early discovery workflows. It positions as a scalable, cost-efficient alternative for brain region-specific gene expression studies in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating RNA from specific brain nuclei to correlate transcript expression with neuronal circuit function and behavioral phenotypes.
- Operational Value: Provides repeatable, cost-efficient sample collection from multiple discrete regions per mouse, reducing animal use and increasing throughput for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers total RNA with sufficient yield and purity for downstream RNA-Seq and qRT-PCR, enabling reliable assay development for gene expression screening in brain tissue models.
- Operational Value: Uses magnetic bead-enabled RNA isolation compatible with high-throughput workflows, supporting standardization across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant transcriptomic profiling in mouse models, aligning with translational biomarker discovery efforts in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders.
- Operational Value: Ensures RNA integrity through RNase-free protocols, improving reproducibility in longitudinal preclinical studies and cross-laboratory data comparability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, where precise brain region RNA profiling informs target selection and prioritization before preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling transcriptomic comparison across discrete brain regions linked to specific neural circuits.
- Screening: Produces standardized RNA inputs suitable for quantitative gene expression screening, enhancing reproducibility in target engagement assays.
- Analytics: Generates high-quality RNA for spectrophotometric and fluorometric quantification, enabling precise input normalization for sequencing and PCR-based applications.
- Translational Research: Connects discovery-phase expression profiling to preclinical continuity by providing disease-relevant transcriptomic data from defined brain regions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue collection and RNA isolation platform applicable across multiple neuroscience projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through precise brain region-specific expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via RNase-free workflows and minimal hands-on time (8–10 minutes per sample).
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling multiple regional samples from a single animal, reducing costs associated with low-yield methods requiring amplification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by delivering reliable transcriptome data for go/no-go decisions in CNS drug discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and RNase-free technique to maintain sample integrity during dissection and RNA extraction.
- Depends on access to a micrometer-operated tissue chopper, set-diameter tissue corers, and magnetic bead-based RNA isolation kits.
- Necessitates standardized RNase-free environment protocols across teams to ensure cross-study consistency in RNA quality.
- Adaptation to other brain regions or species may require optimization of tissue core diameter and sectioning parameters.
- Practical limitation: Manual tissue punching may limit ultra-high-throughput applications compared to automated laser capture systems, though it offers superior RNA yield.
