تتبع التشويهات الأنسجة التخلق في جنين الفرخ المبكر

يتمثل الهدف العام من التقنيات المعروضة هنا في وسم وزراعة الأنسجة الجنينية لقياس التشوه المورفوجيني أثناء النمو المبكر. ولزراعة جنين الدجاج في مراحله المبكرة، ابدأ بإزالة الجنين من البيضة باستخدام طريقة حامل الورق المرشح. وبناءً على التطبيق التجريبي، قم بوسم الجنين المستخلص باستخدام صبغات ليبوفيلية فلورية يتم إيصالها عبر جزيئات الحديد المغناطيسية أو باستخدام كرات ميكروية من البوليسترين. بعد ذلك، تتبع الواسمات أثناء الزراعة باستخدام المجهر الفلوري أو التصوير المقطعي للاتساق البصري.

تشير خرائط انفعال التشكل الناتجة عن التصوير إلى مناطق استطالة الأنسجة وتقصرها وقصها في البعدين الثاني والثالث. مرحباً، اسمي بن فيليس، وأنا طالب دراسات عليا في مختبر الدكتور لاري تابور في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة واشنطن في سانت لويس. قبل البدء في هذه الأنواع من التجارب، من المهم مراعاة تقنيات زراعة الأنسجة ذات الصلة في نظام النموذج الخاص بك، ووسائل التصوير التي قد تكون متاحة لك، وكذلك نوع البيانات التي ترغب في الحصول عليها من تجاربك.

على سبيل المثال، هل أنت مهتم بتحليل تشوهات الأنسجة في بُعدين أو ثلاثة أبعاد؟ نجيب عن بعض هذه التساؤلات اليوم من خلال عرض تقنيتين متكاملتين للوسم في جنين الدجاج في مراحله المبكرة. مرحباً، اسمي فيكتور فارنر، وأعمل في مختبر الدكتور لاري تابور في جامعة واشنطن في سانت لويس.

في كلتا هاتين التقنيتين، نقوم بوسم مئات الخلايا بسرعة وبشكل متزامن في جنين الدجاج في مراحله المبكرة. ويسمح لنا تتبع حركة هذه الوسوم ليس فقط بتحديد الأنسجة التي تستقر فيها هذه الخلايا في النهاية، بل وأيضاً بقياس التشوه على مستوى النسيج الذي يشكل الجنين المبكر. أولاً، قم بحضن البيض في وضع طولي حتى الوصول إلى المرحلة المطلوبة وفقاً لتصنيف hamburger and Hamilton.

قم بكسر الجزء السفلي من البيضة على حافة طبق بتري بقطر 150 millimeter. اسحب القشرة من الأسفل، وأفرغ محتويات البيضة في الطبق، ثم استخدم ملقطاً غير مدبب لإزالة الزلال اللزج الأكثر سماكة من الصفار. الآن، قم بعمل ثقوب في منتصف ورقة ترشيح دائرية.

ضع إحدى حلقات ورق الترشيح فوق المح الصفن بحيث يكون الجنين مرئيًا من خلال الثقب المركزي للحلقة. قم بتقليم المحيط الخارجي لحلقة ورق الترشيح باستخدام مقص دقيق. بعد ذلك، انزع الورقة الملتصق بها الجنين من المح الصفن باستخدام ملقط دقيق، ثم انقع الجنين برفق في حمام من PBS. ولإزالة جزيئات المح الصفن الملتصقة، انقل مجموعة ورق الترشيح إلى طبق زراعة بقطر 35 millimeter.

ضع الجنين بحيث يكون الجانب البطني للأعلى، ثم أحطه بحلقة ثانية من ورق الترشيح. ثبته باستخدام حلقة معدنية واغمر الجنين في وسط استنبات. إذا لم يتم غمر الجنين بالكامل، فقد تتغير هندسة الأنسجة وعملية التشكل اللاحقة بشكل كبير بسبب أحمال التوتر السطحي العالية بشكل غير طبيعي.

أثناء الاستزراع، استخدم مجهراً للمجال الساطع للتحقق من المورفولوجيا الصحيحة والمرحلة الجنينية. أولاً، خذ كمية صغيرة من مسحوق الحديد وأضف بضع قطرات من صبغة مشبعة وكحول، ثم جففها بالهواء باستخدام طرف ماصة دقيقة مسحوبة. قم بتفكيك جزيئات الحديد المتكتلة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

بعد عدة عمليات شطف بغمر العينة في الماء المتأين، يوضع الجنين المحصود بحيث يكون ظهره للأعلى في طبق زراعة بقطر 35 مليمتر مغطى بطبقة وافرة من وسط الزراعة. وباستخدام مجهر تشريحي، استخدم إبرة زجاجية لإزالة الغشاء السيليني وكشف الخلايا الجلدية الكهربائية. الآن، اسحب عموداً من جزيئات الحديد الموصومة داخل ماصة باستور.

باستخدام المجهر التشريحي، اغمر الماصة بحيث تكون في موضع أعلى الجنين مباشرة. قم بتدوير الماصة ببطء ذهاباً وإياباً بين أطراف الأصابع لنثر الجسيمات فوق الجنين. بعد فترة حضانة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة Celsius، قم بإزالة الجسيمات باستخدام مغناطيس قوي.

عند الضرورة، قم بتثبيت المغناطيس بملقط دقيق مغناطيسي، واستخدم الملقط الممغنط لإزالة أي جزيئات حديد متبقية بعناية. انتقل بعد ذلك إلى الحصول على صور للمضغة باستخدام كل من المجال المضيء والفلورية. باستخدام إبرة قياس 22.

اسحب محلولاً من الكرات المجهرية السوداء ذات القطر 10 micrometer في محلول PBS إلى حقنة سعة 10 cc. بعد ذلك، قم ببرد أطراف الإبر الزجاجية المسحوبة باستخدام قرص صلب لجهاز كمبيوتر واملأها بمحلول الكرات. انقر بخفة على الماصة الدقيقة باستخدام مناور دقيق حتى يصل المحلول إلى الطرف.

ضع الإبرة الزجاجية في نفس مجال الرؤية الذي يوجد به الجنين. تأكد من تدفق الحبيبات من طرف الماصة. الآن، أدخل طرف الماصة في تجويف الأنبوب الدماغي.

مع الحرص على عدم ثقب الأرضية البطنية للنسيج. راقب الانتفاخ العابر للنسيج أثناء دخول الخرز والسائل إلى التجويف. ثم قم بإزالة الإبرة الزجاجية بسرعة.

أخيرًا، تحقق من وجود كثافة كافية من الخرزات في التجويف الداخلي لأنبوب الدماغ. وباستخدام مجهر الحقل المضيء، اترك الخرزات تترسب لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة قبل التقاط صور الحقل المضيء أو مجموعة بيانات التصوير المقطعي للاتساق البصري. وبعد التقاط الصور الأولى، ضع ما يصل إلى 7 أطباق زراعة بقطر 35 مليمتر من العينات في طبق بتري بقطر 150 مليمتر، ثم ضع المجموعة بأكملها في كيس بلاستيكي صغير.

أضف قطرات من الماء منزوع الأيونات إلى الكيس للترطيب، ثم املأ الكيس بخليط من 95% oxygen و 5% carbon dioxide. ضع الأجنة في حاضنة بدرجة حرارة 37 degree Celsius حتى نقطة التصوير الزمنية التالية؛ ضع الأجنة المحددة في طبق delta T يحتوي على 1.2 milliliters من وسط الزرع وغطِّ الطبق بغطاء زجاجي محفوظ في درجة حرارة 37 degrees Celsius. قم بتزويد الجنين بتدفق مستمر من خليط غازي مكون من 95% O2 و 5% CO2 يتم توفيره بواسطة جهاز مضخة صغيرة متغيرة التدفق. الآن، قم بضبط البرنامج للحصول على الصور تلقائياً في الفترات الزمنية المطلوبة.

على مدار التجربة، يمكن تتبع العلامات تلقائياً أو يدوياً، كما يمكن حساب خرائط الإجهاد المورفوجينية لإحداثيات العلامات. وهنا، استُخدمت تقنية جزيئات الحديد لوسم وتتبع حركة الخلايا الجلدية الكهربائية أثناء تكوين طية الرأس. وفي الجنين المبكر للدجاج، وُزعت الخلايا الموُسمة فلورياً عبر الجنين بأكمله.

تم التقاط صور بالحقل المضيء وصور فلورية للجنين على فترات زمنية مختلفة أثناء الزراعة خارج البيضة (ex ovo)، وذلك لمراقبة حركات علامات المسار. وتسمح البيانات التراكمية بحساب توزيعات الانفعال المورفوجيني المتطورة أثناء تكوين طية الرأس.

وبالمثل، استُخدمت تقنية الكريات الدقيقة من البوليسترين لتتبع تحركات الأنسجة عند الحدود الوسطى للدماغ الخلفي في دماغ جنين الدجاج في مراحله المبكرة. تجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة قادرة على التعامل مع التشوه ثلاثي الأبعاد بشكل متميز، حيث تميل الكريات إلى الالتصاق بجميع جوانب التجويف الداخلي للدماغ. وبعد تتبع حركات الكريات لمدة ست ساعات، تسمح إحداثيات العلامات بحساب الانفعالات، مما يحدد خصائص تشوه الأنسجة في الاتجاهين الطولي والمحيطي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن بعض الخطوات التجريبية المطلوبة لتنفيذ عملية زراعة الأنسجة ووسمها الخاصة بك. وتتميز تقنيات البروتوكول المعروضة هنا بأنها غير باضعة بشكل طفيف للأنسجة الأصلية، كما أنها تتضمن مواد منخفضة التكلفة ومتاحة بسهولة. وتعد هذه التجارب مفيدة بشكل خاص للدراسات المتعلقة بميكانيكا التطور الجنيني.

بما أن حقول التشوه التي تم حسابها باستخدام تتبع حركة الخلايا المميّزة يمكن استخدامها لاختبار وبناء النماذج الفيزيائية للتخلق الشكلي.