تتبع التشويهات الأنسجة التخلق في جنين الفرخ المبكر

الهدف العام للتقنيات المعروضة هنا هو تسمية وزراعة الأنسجة الجنينية لقياس التشوه المورفوجيني أثناء التطور المبكر لزراعة جنين الكتكوت المبكر ، بدءا من إزالة الجنين من البويضة باستخدام طريقة حامل ورق الترشيح. اعتمادا على التطبيق التجريبي ، قم بتسمية الجنين المستخرج بأصباغ محبة للدهون الفلورية يتم توصيلها عبر جزيئات الحديد المغناطيسية أو باستخدام كريات البوليسترين المجهرية. بعد ذلك ، تتبع الملصقات أثناء الزراعة باستخدام الفحص المجهري الفلوري أو التصوير المقطعي للتماسك البصري.

تشير خرائط السلالة المورفوجينية الناتجة عن التصوير إلى مناطق استطالة الأنسجة والتقصير والقص في كل من الأبعادين والثلاثة. مرحبا ، اسمي بن فيليس وأنا طالب دراسات عليا في مختبر الدكتور لاري تابور في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة واشنطن في سانت لويس. قبل البدء في هذه الأنواع من التجارب ، من المهم مراعاة تقنيات زراعة الأنسجة ذات الصلة في نظام النموذج الخاص بك ، وطرائق التصوير التي قد تتمكن من الوصول إليها ، وكذلك نوع البيانات التي تريدها من تجاربك.

على سبيل المثال ، هل أنت مهتم بتحليل تشوهات الأنسجة في بعدين أو ثلاثة بعدات؟ نتناول بعض هذه الأسئلة هنا اليوم من خلال عرض تقنيتين مجانيتين لوضع العلامات في جنين الكتاكيت المبكر. مرحبا ، اسمي فيكتور فارنر ، وأعمل في مختبر الدكتور لاري تابور في جامعة واشنطن في سانت لويس.

في كلتا التقنيتين ، نقوم بسرعة وفي وقت واحد بتسمية مئات الخلايا في جنين الفرخ المبكر. يسمح لنا تتبع حركة هذه الملصقات ليس فقط بتحديد الأنسجة التي تقيم فيها هذه الخلايا في النهاية ، ولكن أيضا لتحديد تشوه مستوى الأنسجة الذي يشكل الجنين المبكر. أولا ، احتضان البيض في اتجاه طولي إلى المرحلة المرغوبة كما هو محدد من قبل الهامبرغر وهاميلتون.

اكسر قاع البيضة على جانب طبق بتري 150 ملم. افصل القشرة عن الأسفل ، وأفرغ محتويات البيضة في الطبق ، وباستخدام ملقط حاد ، قم بإزالة الألبومين اللزج السميك من صفار البيض. الآن قم بعمل ثقوب في منتصف ورق ترشيح دائري.

ضع إحدى حلقات ورق الترشيح على صفار البيض بحيث يكون الجنين مرئيا من خلال الفتحة المركزية للحلقة. تقليم حول المحيط الخارجي لحلقة ورق الترشيح بمقص صغير. ثم قم بإزالة الورق مع الجنين المرفق من صفار البيض باستخدام ملقط ناعم وانقع الجنين برفق في حمام PBS لإزالة جزيئات الصفار الملتصقة ، انقل مجموعة ورق الترشيح إلى طبق ثقافة 35 ملم.

وضعه الجانب البطني لأعلى, أرسل أي الجنين مع ثانية مرشح ورقة حلقة. قم بتثبيته بحلقة معدنية واغمر الجنين في وسط الاستزراع. إذا لم يتم غمر الجنين بالكامل ، فيمكن تغيير هندسة الأنسجة والتشكل اللاحق بشكل كبير من خلال أحمال التوتر السطحي العالية بشكل غير طبيعي.

أثناء الاستزراع ، باستخدام مجهر ساطع ، تحقق من التشكل المناسب والمرحلة الجنينية. أولا ، خذ كمية صغيرة من مسحوق الحديد وأضف بضع قطرات من الصبغة المشبعة والكحول وجففها في الهواء بطرف ماصة صغيرة مسحوبة. قم بتفكيك جزيئات الحديد المتكتلة ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

بعد عدة شطف مغطاة بموضع الماء المتأين ، يتم وضع موقع الجنين الظهري المحصود في طبق استزراع 35 ملم مغطى بطبقة سخية من وسط الاستزراع. تحت مجهر تشريح ، استخدم الإبرة الزجاجية لإزالة غشاء فيلين وفضح خلايا الجلد الكهربائي. الآن ارسم عمودا من جزيئات الحديد المسمى في ماصة بيور.

باستخدام مجهر التشريح ، اغمر الماصة لوضعها فوق الجنين مباشرة. قم بلف الماصة ببطء ذهابا وإيابا بين أطراف الأصابع لرش الجزيئات عبر الجنين. بعد حضانة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة الجسيمات باستخدام مغناطيس قوي.

إذا لزم الأمر ، قم بتوصيل المغناطيس بزوج مغناطيسي من الملقط الدقيق واستخدم الملقط الممغنط لإزالة أي جزيئات حديد متبقية بعناية. تابع الحصول على صور الحقل الساطع والفلورسنت للجنين. بإبرة قياس 22.

اسحب محلولا من الكريات المجهرية السوداء بقطر 10 ميكرومتر في PBS إلى حقنة 10 سم مكعب. ثم شطبة أطراف الإبر الزجاجية المسحوبة باستخدام محرك الأقراص الثابتة للكمبيوتر وملء مع حل الخرز. قم بنقر الماصة الدقيقة برفق حتى يصل المحلول إلى الطرف باستخدام مناور صغير.

ضع الإبرة الزجاجية في نفس مجال رؤية الجنين. تأكد من تدفق الخرزات من طرف الماصة. الآن أدخل طرف الماصة في تجويف أنبوب الدماغ.

الحرص على عدم اختراق الأرضية البطنية للأنسجة. راقب التورم العابر للأنسجة عندما تدخل الخرزات والسوائل إلى التجويف. ثم قم بإزالة الإبرة الزجاجية بسرعة.

أخيرا ، تحقق من كثافة حبة كافية في التجويف الداخلي لأنبوب الدماغ. باستخدام مجهر المجال الساطع ، دع الخرزات تستقر لمدة 20 إلى 30 دقيقة قبل الحصول على صور المجال الساطع أو مجموعة بيانات التصوير المقطعي للتماسك البصري. بعد الحصول على الصور الأولى ، ضع ما يصل إلى 7 أطباق استزراع 35 ملم من العينات في طبق بتري مقاس 150 ملم وضع المجموعة بأكملها في كيس بلاستيكي صغير.

أضف قطرات من الماء منزوع الأيونات إلى الكيس للترطيب ، ثم املأ الكيس بمزيج من 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ضع الأجنة في حاضنة 37 درجة مئوية حتى النقطة الزمنية التالية للتصوير ، ضع الأجنة المسمى في طبق دلتا T يحتوي على 1.2 مل من وسط الثقافة وقم بتغطية الطبق بغطاء زجاجي محفوظ عند 37 درجة مئوية ، قم بدمج الجنين بخليط غاز 95٪ O2 5٪ CO2 يتم توفيره من جهاز تدفق متغير لمضخة صغيرة. الآن قم بإعداد البرنامج للحصول تلقائيا على الصور التي ترغب في فترات زمنية

على مدار التجربة ، يمكن تتبع الملصقات تلقائيا أو يدويا ، ويمكن حساب خرائط سلالة الوراثة لإحداثيات العلامات. هنا ، تم استخدام تقنية جسيمات الحديد لتسمية وتتبع حركة خلايا الجلد الكهربائي أثناء تكوين طية الرأس. في جنين الكتاكيت المبكر ، تم توزيع الخلايا ذات العلامات الفلورية عبر الجنين بأكمله.

تم التقاط صور Brightfield والفلورسنت للجنين على فترات مختلفة أثناء ثقافة ex ovo. لمراقبة حركات ملصقات المسالك. تسمح البيانات التراكمية بحساب توزيعات السلالة المورفوجينية المتطورة أثناء تكوين طية الرأس.

وبالمثل ، تم استخدام تقنية الكرة المجهرية للبوليسترين لتتبع حركات الأنسجة في منتصف حدود الدماغ الخلفي لدماغ الفرخ المبكر. لاحظ أن هذه الطريقة قادرة على التعامل مع تشوه ثلاثي الأبعاد بشكل واضح حيث تميل الخرزات إلى الالتصاق بجميع جوانب التجويف الداخلي للدماغ. بعد تتبع حركات الخرزة لمدة ست ساعات ، تسمح إحداثيات العلامات بحساب السلالات ، وتميز تشوه الأنسجة في الاتجاهين الطولي والمحيطي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن بعض الخطوات التجريبية المطلوبة لتنفيذ زراعة الأنسجة الخاصة بك ووضع العلامات عليها. تعتبر تقنيات البروتوكول المعروضة هنا مفيدة بشكل خاص من حيث أنها طفيفة التوغل للأنسجة الأصلية وأنها تتضمن أيضا مواد منخفضة التكلفة ومتاحة بسهولة. هذه التجارب مفيدة بشكل خاص للدراسات حول آليات التطور الجنيني.

نظرا لأن حقول التشوه المحسوبة باستخدام الحركة المتعقبة للخلايا المسماة يمكن استخدامها لاختبار وبناء النماذج الفيزيائية للتشكل.