وPCR لتحديد Allelotyping السالمونيلا enterica serovars الملهبة ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد أليلات مستضد السلمونيلا النوعية. ويتم تحقيق ذلك من خلال استهداف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتحديد اختلافات تسلسلية محددة مرتبطة بهذه الأليلات. تُضاف عينة القالب إلى مزيج تفاعل PCR يحتوي على بادئات نوعية للأليلات وتنميط الأليل OH one وH two.

تُجرى تفاعلات PCR في جهاز التدوير الحراري. بعد ذلك، يتم فصل عينات PCR حسب الحجم باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام لتحديد حجم قطعة الحمض النووي المضخمة (amplicon) في حال وجودها لكل عينة أو لعزلها. ثم يتم ربط حجم القطعة المضخمة بالحجم المتوقع لكل مجموعة من البادئات المستخدمة في نتائج PCR التي تظهر تحديد مستضد السالمونيلا المحدد.

يتم بعد ذلك تحديد التصنيف النمطي المصلّي (SEROVAR) للأليلات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بناءً على نتائج اختبارات PCR المتعددة لـ OH one و H two. وتتمثل الميزة الرئيسية للبروتوكول الموضح في هذا الفيديو مقارنةً بـ SYP في كونه سريعاً وأسهل في التفسير وأقل تكلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأوبئة، مثل تحديد توزيع واستمرار سلالات salmonella VARs داخل مزارع الدواجن أو الألبان أو بينها.

تمتد تطبيقات هذه التقنية نحو التشخيص السريع لداء السلمونيلات الناجم عن السلمونيلة، من الأنماء المصلية arius أو urian. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لفهم كيفية استخدام هذه الطريقة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتصنيف السلمونيلة وصولاً إلى مستوى النمط المصلي. ستقوم أدريانا بيدروسو وين تشانغ، الباحثتان العلميتان في مختبرات لي ماور بجامعة جورجيا، باستعراض هذا الإجراء لتحضير قالب الحمض النووي (DNA) للخلية الكاملة لتفاعل PCR اللاحق.

أولاً، يتم تلقيح ملليمتر واحد من مرق LB ببكتيريا salmonella. يتم العزل من مستعمرة واحدة. تُحضن المزرعة مع الرج بسرعة 200 إلى 250 دورة في الدقيقة وعند درجة حرارة تحضين تبلغ 37 degrees Celsius.

في اليوم التالي، انقل 1 mL من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL، وقم بطرد المعلق مركزياً لمدة دقيقتين تقريباً عند 4,500 ×g لترسيب الخلايا، ثم اسحب السائل الطافي، وبعد ذلك أعد تعليق الرواسب البكتيرية في 1 mL من الـ 100% Ethanol. قم بحضن الخلايا المعلقة في الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً كما في السابق. أعد تعليق الرواسب في 1 mL من PBS. بعد الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي وأعد تعليق الرواسب في 1 mL من الماء المقطر المعقم. وأخيراً، قم بتخفيف معلق الخلايا.

يُخفف بنسبة 1:20 باستخدام ماء مقطر ويُخزن في درجة حرارة 20- درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد حتى يحين وقت تحضير تفاعل PCR؛ ويجب إجراء عملية تحضير وتوزيع خليط تفاعل PCR في غرفة منفصلة مادياً، ويفضل أن يكون ذلك في محطة عمل مخصصة لتفاعل PCR ومجهزة بمصباح UV. أولاً، يتم تطهير سطح العمل باستخدام مصباح UV والمسح بمحلول مبيض بتركيز 10%. بعد ذلك، تُستخدم ماصة مخصصة حصرياً لأعمال PCR ومزودة بطرف ماصة عازل (barrier pipette tip).

قم بإعداد مخزون رئيسي من البادئات عن طريق تخفيف البادئات أولاً بماء مقطر لتصل إلى تركيز 5 × 10⁻⁴ molar. بعد ذلك، خفف المخزون بنسبة 1 إلى 20 بماء مقطر للوصول إلى تركيز العمل البالغ 25 micromolar. استخرج كواشف الـ PCR وقالب الخلايا الكاملة من المجمد وأذبها على الثلج.

اترك إنزيم tac DNA polymerase في المجمد حتى يحين وقت استخدامه. اخلط كواشف PCR وفقاً للجدول رقم واحد من البروتوكول المكتوب. بعد ذلك، اسحب بواسطة الماصة 9 µL من تفاعل PCR.

امزج المكونات في آبار لوحة معايرة دقيقة من البوليسترين معقمة ذات 96 بئراً مستديرة القاع. ابدأ من أعلى العمود الأول وانتقل إلى أسفل العمود، ثم انتقل إلى أعلى العمود التالي؛ أضف 1 µL من الماء المقطر إلى البئر الأول ليكون بمثابة ضابط سلبي. بعد ذلك، وزع 0.5 µL من قوالب الضابط الإيجابي على مزيج PCR في البئر الثاني، و 1 µL من e coli K 12 DH five alpha في البئر الثالث.

سنضيف 1 µL من قالب العينة الثالثة إلى الآبار المتبقية لـ H1 و gyp PCR؛ حيث ستعمل Salmonella enterica CVaR TYM و Enteritidis كضوابط موجبة للأليلات H1 و GM على التوالي. أما Salmonella CVaR Heidelberg و Haar فهما الضوابط الموجبة التي ستُستخدم في تفاعل PCR الثاني لتنميط أليل H1 للكشف عن الأليلين r و z10 على التوالي. بعد ذلك، ضع شعيرات زجاجية سعة 10 µL في الحوامل المخصصة لتقنية Idaho.

بمجرد تثبيت جهاز التدوير السريع (Rapid cycler) في الحامل، قم بتعبئة كل أنبوبة شعرية زجاجية بخليط تفاعل PCR عن طريق ملامسة الأنابيب الشعرية لقاع الآبار. قم بإمالة الحامل للسماح للسائل بالتحرك إلى أسفل الأنبوبة وتوفير مساحة بين النهايات وخليط PCR. وقبل إغلاق الأنابيب الزجاجية حرارياً باستخدام مشعل بوتان لإحكام سد طرفي الأنابيب الشعرية، ضع الأنابيب الشعرية والحامل في جهاز التدوير السريع من Idaho technology واستخدم برامج المدوّر الحراري الموضحة في الجدول رقم 1 من البروتوكول المكتوب لمختلف أنواع الـ PCR من طراز all ELO.

بمجرد اكتمال برنامج الجهاز المدوّر الحراري، انتقل إلى خطوة الفصل الكهربائي للهلام باستخدام هلام أغاروز بدرجة نقاء البيولوجيا الجزيئية بنسبة 1.5% وبمقاس 15 في 10 سنتيمتر، يحتوي على بروميد الإيثيديوم وفقاً للإجراءات القياسية. وبمجرد تصلب الهلام، انقله إلى غرفة فصل كهربائي أفقية مغمورة تحتوي على منظم TAE بتركيز 1× ممزوج مسبقاً بـ 200 ميكرولتر بتركيز 0.25 مليغرام لكل مليليتر.

أضف 4.8 µL من علامة الوزن الجزيئي للحمض النووي DNA المخلوطة مسبقاً مع 40 µL من صبغة تحميل DNA بتركيز ستة أضعاف إلى الآبار الأولى والوسطى والأخيرة. بعد ذلك، أخرج أنبوباً شعرياً زجاجياً يحتوي على تفاعل عينة PCR من الحامل وقم بخدش طرفي الأنبوب الشعري باستخدام قاطع الزجاج. ثم ضع إبهام وسبابة كلتا اليدين على جانبي الأنبوب الشعري عند العلامة التي حددها قاطع الزجاج وقم بكسر الأنبوب الشعري؛ ضع موزّع الأنابيب الشعرية على الطرف المقابل لمزيج تفاعل PCR وأدر المكبس ببطء في اتجاه عقارب الساعة حتى يصل السائل إلى قاع الأنبوب تماماً.

ضع الأنبوب الشعري في البئر المراد تحميله، وأدر المكبس ببطء في اتجاه عقارب الساعة لتفريغ العينة الموزونة في البئر. احذر من ثقب البئر بالأنبوب الشعري أو إدخال فقاعة هواء في البئر عن طريق الاستمرار في تدوير المكبس بعد خروج آخر قطرة من السائل من الأنبوب الشعري. بمجرد تحميل جميع العينات والمعايير، اضبط الجهد الثابت لمزود الطاقة على 90 volts.

عند الانتهاء من عملية الرحلان الكهربائي، انقل الهلام إلى جهاز تصوير بالأشعة فوق البنفسجية (UV trans illuminator) لتصور قطع DNA ومعايير الوزن الجزيئي، ثم التقط الصور باستخدام نظام gel dock XR. وأخيراً، ضع حوامل الشعيرات في محلول مبيض بتركيز 10% لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة، ثم اشطفها ثلاث مرات بالماء المقطر وأعدها إلى غرفة تجهيز PCR لتجف في الهواء.

تُظهر هذه الهلامية الأولى المصبوغة ببروميد الإيثيديوم نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد (multiplex PCR) للأليل O المرتبط بـ salmonella entera var, enteritis, hadda Heidelberg.Antifa. يحتوي المساران 1 و13 على سلم DNA بحجم 100 base pair.

يحتوي المسار الثاني على ضوابط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المتعدد للأليلات B، وC1، وC2، وD1، وE. أما المسارات المتبقية من الثالث إلى الثاني عشر فتحتوي على عزلات السالمونيلا (salmonella). يتم تحديد مسمى الأليل لعزلة السالمونيلا بناءً على تطابق حجم قطعة التضخيم (amplicon) مع حجم ضابط PCR، وكما هو متوقع لمجموعات البادئات (primer sets) المستخدمة من اليسار إلى اليمين. وتكون أحجام قطع التضخيم هذه كما يلي: D1 بطول 620 base pairs، وC2 بطول 400 base pairs، وE بطول 280 base pairs، وC1 بطول 340 base pairs، وB بطول 560 base pairs.

تُظهر هلام صبغة بروميد الإريديوم هذه نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المتعدد للأليل H1 لتحديد أليلات FLA في eye و gm. تم تحميل الهلام بنفس الترتيب الموضح سابقاً. ومرة أخرى، يتم تعيين أليل H1 لكل عزل، وذلك بناءً على وجود ناتج تضخيم يتطابق في الحجم مع ضابط PCR، وكما هو متوقع لمجموعات بادئات الأليل H1 الأربع المستخدمة من اليسار إلى اليمين.

تبلغ أحجام النواتج التضخيمية لـ GM 310 زوج قاعدي ولـ I 510 زوج قاعدي. يوضح هلام صبغة بروميد الإيثيديوم هذا نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد (multiplex PCR) للأليل H one لتحديد أليلات gellin من نوع r و z 10. ومرة أخرى، تم تحميل الهلام بنفس الطريقة الموضحة سابقاً، ويتم تعيين الأليل H one لكل عزلات بناءً على وجود ناتج تضخيمي يتطابق في الحجم مع ضابط تفاعل PCR، وكما هو متوقع لمجموعات بادئات الأليل H one الأربع المستخدمة، فإن أحجام النواتج التضخيمية هي R 170 زوج قاعدي و Z ten 360 زوج قاعدي بمجرد إتمام العملية.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، تذكر الفصل مادياً بين تحضير القالب وإعداد تفاعل PCR والترحيل الكهربائي للهلام عن بعضها البعض، وذلك لتقليل احتمالية حدوث تلوث ناتج عن انتقال ملوثات تفاعل PCR.