Name: ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: تعلم تقنية تشريح وصبغ ظهارة بطن يرقات ذبابة الفاكهة للمناعة النسيجية. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة التشكل الظهاري وإعادة تنظيم الأنسجة في علم الأحياء التنموي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية.

1. اليوم 1 قبل البدء : ينبغي الحفاظ على صحة السكان من الذباب باستخدام بروتوكولات زراعة القياسية : إزالة البالغين من زجاجات أو قوارير بعد 3-4 أيام من وضع البيض ، والسماح التنمية والمضي قدما في درجة حرارة ثابتة حتى يتجول 3 اليرقات طور مرحلي بدء pupariation الثالثة. يتم وضع علامة على انتقال اليرقات / العذراء قبل تشكيل prepupae (نظرت 0 بعد ساعات من تشكيل puparium - APF). وتتميز الشرانق متحركة من كبار السن الشرانق التي تلون بها من البيض واليرقات التي لم تبدأ بعد pupariation التي مستطيل وشكلها مستدير ، وبروز لspiracles الأمامي. ستحتاج إلى : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرشاة طلاء لجمع الشرانق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء غرفة رطبة لزراعة الشرانق : طبق بيتري اصطف مع منشفة ورقية مرطبة ومغطاة رقة الترشيح ملحوظا لنقاط زمنية مختلفة من التركيب الوراثي ، وجمع أو الجنس من الشرانق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لغسل الشرانق </li></ul> جمع وزراعة والتدريج الشرانق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفرشاة المبللة إزالة بلطف 0hr APF الشرانق من زجاجات ثقافة / قنينات ووضعها في غطاء حجرة رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة الرسام وبرنامج تلفزيوني 1X غسل بلطف لإزالة الحطام الشرانق من القضية خادرة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ضروريا لفرز الشرانق حسب نوع الجنس. يمكن استخدام primordia الغدد التناسلية من الشرانق لفرز الجنسين. وprimordia التناسلية الذكور هي زوج من الأقراص الشفافة الوحشي ينظر اليه بسهولة من خلال ما يقرب من إهاب العذراء 03/02 باستمرار طول الجسم 5. وprimordia التناسلية الأنثى هي أصغر وليس تحديدها بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرانق في الموقف المسمى بشكل مناسب في الغرفة الرطبة والعودة الى درجة حرارة ثابتة. الثقافة إلى نقطة زمنية التنموية المناسبة. </li></ol> 2. 2 اليوم : تشريح وتثبيت الحضانة والابتدائي الأضداد قبل البدء : ستحتاج إلى : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط جراحي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبضع الجراحة مع رقم 11 ريش </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اثنين من الاكتئاب الزجاج تسعة أطباق جيدا (كورنينج المنتج # 7220-85) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تملأ الآبار من صحن واحد مع 1X PBS : هذا هو الطبق الشطف لتنظيف الشرانق تشريح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق من الآبار الثانية مع العازلة التثبيت </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغرفة الرطبة للحضانة الأضداد. نستخدم صناديق بلاستيكية شطيرة اغلاقها باحكام اصطف مع المناشف الورقية المبللة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة التثبيت : 1X PBS ، بارافورمالدهيد 4 ٪ ، وحمض deoxycholic 0.2 ٪ (على permeabilization) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منصة التشريح : مسح شريحة المجهر مع قطعة من الشريط على الوجهين انضمت الى جانب واحد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P100 P200 أو pipettor </li></ul> تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط إزالة بلطف one الشرانق في وقت ووضعها على منصة التشريح مع نهاية الأمامي من الشرانق التي تواجه أوسع عرض الشريط. إذا الشرانق والرطب بشكل مفرط ، أولا وصمة عار لهم الجافة باستخدام منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الشرانق انضمت تماما على الشريط ، واستخدام الفرشاة لوضع لهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للعذارى في الهواء الجاف والتمسك الشريط (5-10 دقائق) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مشرط الجراحة تشريح كل الشرانق ثنائيا. هذا هو أفضل إنجاز مع خفض سريع واحد من الأمام إلى نهاية الخلفي من الشرانق. إذا فعلت بشكل صحيح ، فإن خفض شطر الأمامية والخلفية على حد سواء spiracles أزواج. تشريح لا يزيد عن 10 الشرانق في وقت والغسيل والتنظيف العينات بسرعة اللازمة لمنع الضرر للبروتين الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة الرسام ، ونقل كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني 1X لكل الشرانق تشريح للتخفيف عليهم من الشريط. </li></ol> التنظيف ، وتثبيت الحضانة والابتدائي الأضداد <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من ملقط الجراحة فهم نصف خادرة الفردية الأمامية وتزج فورا في بئر للطبق الشطف. ينبغي الاستعاضة عن منصة التشريح بواسطة الطبق الشطف على المسرح المجهر. وينبغي أن يترك القضية الشرانق على العينة حتى يتم استكمال تجهيز العينات وتكون جاهزة للتركيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين لا يزال يمسك النصف خادرة استخدام pipettor لغسل بلطف بعيدا الأنسجة الداخلية من البطن. يمكن الضغط كثيرا أثناء الغسل تؤدي إلى فقدان الخلايا الظهارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور النصف خادرة نظيفة لتثبيت العازلة في درجة حرارة الغرفة وعملية الباقية نصفين خادرة بالمثل. مع أن الممارسة ، تشريح وغسل نصفي خادرة 20 تستغرق أقل من 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لاحتضان الشرانق في تثبيت العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 (واحد) ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشرانق 3X الثابتة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني 1X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تتم معالجتها على الفور عينات لالمناعية أو قد تكون مخزنة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر دون فقدان الخلايا أو التفاعل حاتمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتخزين العينات وعينات تتوازن من خلال تخفيفسلسلة من برنامج تلفزيوني : EtOH (3:1 ، 1:1 ، 1:3) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في كل تمييع قبل الانتقال إلى EtOH 100 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تكون العينات إعادة معايرتها في برنامج تلفزيوني من خلال سلسلة لعكس قبل معالجة المناعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة العينات في برنامج تلفزيوني 1X (تستكمل مع ألبومين المصل البقري 2 ٪) لمدة 1 (واحد) قبل ساعة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الأولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخفف الى التركيز المناسب في برنامج تلفزيوني 1X طوال الليل في 4 درجات مئوية دون هزاز. </li></ol> 3. يوم 3 : الحضانة الضد الثانوي ، التركيب والتصوير قبل البدء : ستحتاج إلى : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اثنين ملقط جراحي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصاعد وسائل الإعلام (الجلسرين ، Vectashield [المتجهات مختبرات] ، أو Slowfade الذهب [Invitrogen]) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاكتئاب جيدا الشرائح المجهر (0.8 ملم) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips (24 × 40 ملم) </li></ul> الثانوية حضانة الأضداد وتصاعد : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات 3X 10 دقيقة مع كل برنامج تلفزيوني 1X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة العينات في برنامج تلفزيوني 1X (تستكمل مع ألبومين المصل البقري 2 ٪) لمدة 1 (واحد) قبل ساعة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف إلى التركيز المناسب في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة في الظلام لساعات دون هزاز (ثلاثة) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات 3X 10 دقيقة مع كل برنامج تلفزيوني 1X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ذلك مناسبا ، ملون مباين الشرانق (مثال صمة عار علينا النوى مع دابي [4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole] مخففة في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن العينات (لا تقل عن 30 دقيقة) في وسائل الإعلام المناسبة قبل التركيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شريحة العينة. في التشكل من الشرانق يمنع تصاعد مسطحة. هي التي شنت في البئر عينات من شريحة الاكتئاب (الشريحة قطرة) للتصوير. 75 100ul مكان من وسائل الإعلام في تصاعد الاكتئاب أيضا. يمكن تركيب عدة عينات على شريحة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب إزالة حالة خادرة من العينات قبل التركيب. فهم حالة الفرد خادرة يجري الأمامية تأكد من عدم فهم الغشاء الداخلي العذراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الزوج الثاني من ملقط فهم بلطف الغشاء الداخلي العذراء من قبل رئيس وإزالته من حالة العذراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور إلى عينة من الاكتئاب وكذلك متابعة معالجة عينات إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط أو موقف المسبار عينات بشكل موحد في الاكتئاب جيدا مع السطح الوحشي مواجهة. ويمكن إزالة فقاعات الهواء في بعض الأحيان مع التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض بلطف ساترة على العينات مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء </li></ol> 4. ممثل النتائج : إعداد العينات باستخدام هذا البروتوكول الإبقاء على التشكل الإجمالي من البطن الكبار. قد يكون من المتوقع مداخن الصورة لتوليد صورة ثنائية الأبعاد أو جعلها 3 - D يمكن تطبيقها لتحقيق طوبولوجيا البطن. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. وكانت تصور في 26 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) مع الماوس المضادة للWG (4D4 : أيوا ورم هجين البنك الدولي) : منتجات التجزئة في جينات ذبابة الفاكهة البروتين الشرانق مجنح والتعبير Engrailed (UAS - GFP اون gal4). ومكافحة GFP. التكبير 10x ، هو الأمامي الأيسر والظهري متروك. وcounterstained Nucleii مع دابي. وكان من المتوقع حوالي 50 رزمة من الصور (ΔZ بين شرائح غير 2.5μm).

<ol><li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li>
<li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li>
<li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangements%2C+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li>
<li>Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن استخدام التقنيات المعروضة في هذا الفيديو لإعداد عذارى ذبابة الفاكهة من مجموعة متنوعة من النقاط الزمنية التنموية. الشرانق معالجتها خلال الفترة من 24 ساعة إلى 32 ساعة APF APF هي الأكثر عرضة لفقدان الخلية من الظهارة. استخدام المنظفات (مثل 100 - X تريتون وتوين 20) خلال الخطوات حضانة طويلة يزيد من احتمال فقدان الخلية وبالتالي لا يوصى. بدلا من ذلك ، يتم استخدام حمض deoxycholic باعتبارها خطوة المنظفات خلال التثبيت الأولي. يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في برنامج تلفزيوني 1X دون المنظفات. بالإضافة إلى ذلك ، هزاز عينات خلال الخطوات حضانة طويلة يزيد من فقدان الخلية ويجب تجنبها. ولا يمكن تصوير العينات باستخدام تقنيات الفحص المجهري متحد البؤر. ويمكن أيضا ومع ذلك ، ذبابة الفاكهة الشرانق معالجتها كما هو موضح يمكن تصوير المجهري باستخدام الإضاءة هيكلة النظام العائد جودة الصورة مشابهة لتقنيات مبائر.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط جراحي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبضع الجراحة مع رقم 11 ريش </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كذلك تسعة أطباق الاكتئاب الزجاج (كورنينج المنتج # 7220-85) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرفة رطبة لزراعة الشرانق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 11 مشرط جراحي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريط على الوجهين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة التثبيت : 1X PBS ، بارافورمالدهيد 4 ٪ ، وحمض deoxycholic 0.2 ٪ (على permeabilization) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P100 P200 أو pipettor </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاكتئاب جيدا الشرائح المجهر (0.8 ملم) </li></ul>

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

بطن العذراء ذبابة الفاكهة هو نظام أنشئ نموذج لدراسة التشكل الظهارة وتطوير morphologies جنسيا ديمبرافيك 1-3. خلال pupation ، الذي يمتد نحو 96 ساعة (عند 25 درجة مئوية) ، والسكان من الخلايا المتكاثرة تخيلي استبدال البشرة اليرقات لإنشاء شرائح البالغين في البطن. تخيلي هذه الخلايا ، ولدت خلال مرحلة التطور الجنيني ، كما توجد أزواج الوحشي للأعشاش أرومة منسجة في كل جزء من البطن اليرقات. أربعة أزواج من أعشاش أرومة منسجة تؤدي إلى إهاب الظهرية الكبار (أعشاش الظهري الأمامي والخلفي) ، وإهاب بطني (أعشاش بطني) وspiracles المرتبطة بكل قطعة (منتفس أعشاش) 4. puparation على هذه الخلايا مضاعفا (مميزة من حيث حجم أكبر من اليرقات المتعددة الصبغيات موظفين المدنيين المحليين خلايا البشرة) بدء عملية النمطية للهجرة ، والانتشار واستبدال موظفين المدنيين المحليين. ويمكن استخدام مختلف الأدوات الجزيئية والجينية للتحقيق في مسارات مساهمات الجينية التي تساهم في التشكل من البطن الكبار. عادة يتم تحليل الظواهر الكبار النهائي تشريح التالية من البشرة البطن الكبار. ومع ذلك ، والتحقيق في العمليات الجزيئية الكامنة وراء يتطلب تحليلات المناعى للظهارة العذراء ، والتي تشكل تحديات فريدة من نوعها. زمنيا التشكل الحيوي والتفاعلات من المجموعتين السكانيتين الظهارية مميزة (اليرقات وتخيلي) توليد الأنسجة الهشة عرضة لفقدان الخلية المفرطة خلال تشريح ومعالجة لاحقة. وقد طورنا أساليب التشريح ، التثبيت ، وتصاعد والتصوير من ذبابة الفاكهة abdominem ظهارة العذراء للدراسات المناعى التي تولد متسقة عينات عالية الجودة مناسبة لالمجهري الفلورسنت مبائر أو القياسية.

تلوين الأجسام المضادة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الشرانق يمكن تعزيز التحليلات الجينية الوراثة الكبار التنموية في البطن. نقدم لدينا بروتوكول تلطيخ تشريح ، وتثبيت الأجسام المضادة للنظم<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البطن العذراء.

تُعد بطن خادرة ذبابة الفاكهة (Drosophila) نظاماً نموذجياً معتمداً لدراسة التشكيل الظهاري وتطور التمايز الجنسي...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير الظهارة البطنية لـ drosophila puy من أجل الكيمياء النسيجية المناعية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح drosophila puy في مرحلة معينة من الجانبين، وإزالة الأعضاء الداخلية بحيث تظل الظهارة البطنية المكونة من الخلايا التخيلية المتكاثرة، والخلايا المكونة للعظم، والخلايا البشرية اليرقية فقط مرتبطة بغشاء pupil.يتم بعد ذلك تثبيت النسيج وتحضينه مع الأجسام المضادة المستخلصة من غلاف الحدقة الخارجي، ثم يتم تصويره باستخدام مجهر التألق المناعي لإظهار المورفولوجيا العامة للظهارة البطنية والتعبير عن البروتينات المستهدفة. مرحباً، أنا جون يودر، ومختبري موجود في جامعة ألاباما في قسم العلوم البيولوجية.مرحباً، أنا "وي ون"، طالب زميل في مختبر "يودا". سنعرض لكم اليوم طريقتنا في تشريح خادرة ذبابة الفاكهة (drosophila)، والصبغ الكيميائي النسيجي المناعي لبطن خادرة ذبابة الفاكهة (drosophila).يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة عمليات التشكيل الظهاري وإعادة تنظيم الأنسجة. ونحن نستخدم هذه التقنية تحديداً لبحث تطور المورفولوجيا ثنائية الشكل الجنسي في بطن ذبابة الدروزوفيلا البالغة. من قارورة تجمع تحتوي على مجتمع عند درجة حرارة 25 degrees Celsius خالية من البالغين، يتم تحديد العذارى التي ثبتت مؤخراً والتي لم تبدأ جلودها الخارجية في التلون بعد، وتعتبر هذه العذارى في الساعة صفر من مرحلة الـ PF. وباستخدام فرشاة رسم مبللة، قم بإزالة هذه العذارى برفق ووضعها على غطاء غرفة ترطيب. وباستخدام فرشاة الرسم و PBS، قم بغسل الشوائب من أغلفة العذارى برفق إذا لزم الأمر.قم بفرز صغار السرطان حسب الجنس عند الساعة صفر. يمكن رؤية بادئات المهماز الذكرية في PF بسهولة من خلال جلد الحدقة. أما في الإناث، فتكون بادئات المهماز أصغر حجماً ويصعب تحديدها، وتقع تقريباً على ثلثي المسافة نزولاً في الجسم.الآن، ضع العذراء على ورقة الترشيح المبللة داخل الغرفة المرطبة. استبدل الغطاء وأعدهم إلى بيئة ذات درجة حرارة ثابتة. عندما تصل الحيوانات إلى النقطة الزمنية التنموية المطلوبة، ابدأ في عملية التشريح.يرجى الانتباه إلى أن الحدقات التي تمت معالجتها لمدة 24 إلى 32 ساعة في محلول PF هي الأكثر عرضة لفقدان الخلايا الظهارية أثناء عمليات المعالجة اللاحقة. استعد لعملية التشريح عن طريق وضع قطعة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه على طول أحد جانبي شريحة شفافة. بعد ذلك، استخدم الملقط للإمساك بكل حدقة برفق من بين الكرات الأمامية ووضعها على الشريط بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى.قم بمحاذاة 10 قطع كحد أقصى من معدات الوقاية الشخصية (PPE) بهذه الطريقة، وإلا ستواجه خطر العمل ببطء شديد. في غضون خمس إلى 10 دقائق، ستجف معدات الوقاية الشخصية تماماً، ولكن قبل حدوث ذلك، استخدم فرشاة تلوين لتوزيعها بشكل متساوٍ ووضعها في وضع متوازٍ. إن التجفيف لفترة طويلة في هذه المرحلة سيقلل من جودتها.لذا تحرك بسرعة. الآن استخدم مشرطاً جراحياً لتشريح كل خادرة A من كلا الجانبين. قم بإجراء قطع سريع واحد من الطرف الأمامي إلى الطرف الخلفي للخادرة.إذا تم تنفيذ القطع بشكل صحيح، فسيقسم الزوجين الكرويين الأمامي والخلفي إلى نصفين، مما ينتج عنه نصفان أيمن وأيسر متماثلان لتحرير العذراء من الشريط. استخدم فرشاة رسم لوضع كمية صغيرة من PBS على كل عذراء تم تشريحها باستخدام ملاقط جراحية. أمسك نصف إحدى العذراء من طرفها الأمامي واغمره في طبق شطف مملوء بـ PBS على منصة المجهر التشريحي، وأثناء الإمساك بالعذراء، استخدم ماصة لغسل الأنسجة الداخلية بلطف عن طريق ضخ PBS داخل التجويف البطني.تجنب الضغط الزائد حتى لا تُفقد الخلايا من الظهارة. اغمر النسيج النظيف فوراً في 400 µL من محلول التثبيت في درجة حرارة الغرفة، وقم بتنظيف جميع أنصاف العذراء. وبالمثل، مع التدريب على التشريح والغسيل، يجب أن تستغرق العملية لـ 20 نصف عذراء أقل من خمس دقائق.اترك البراعم لتتحضن في محلول التثبيت في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، ثم اشطفها ثلاث مرات في 400 µL من PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة. ولتخزين العينات أولاً، اشطفها مرتين في 100% methanol، ثم انقلها إلى 100% ethanol للتخزين. يمكن تخزين هذه العينات في 100% ethanol عند -20 °C لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر دون أي فقدان للخلايا أو تفاعلية المستضد.لمعالجة العينات المخزنة، يجب أولاً إعادة ترطيبها في PBS من خلال سلسلة من الإيثانول. تابع إجراء الكيمياء النسيجية المناعية عن طريق حجب العينات في PBS مع 2%BSA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وبدون هز. إن هز العينات يزيد بشكل كبير من فقدان الخلايا من الظهارة البطنية.بعد ذلك، استبدل محلول الحجب بالأجسام المضادة الأولية المخففة إلى التركيز المناسب في PBS. قم بتحضين العينات طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C بدون هز، وذلك في غرفة مغلقة مرطبة لمنع التبخر في اليوم التالي. اغسل العينات ثلاث مرات في PBS بدون هز، ولمدة 10 دقائق لكل غسلة.بعد ذلك، يتم حجب العينات لمدة ساعة واحدة بدون تحريك في محلول PBS مع 2%BSA. استبدل محلول الحجب بالأجسام المضادة الثانوية في محلول PBS في درجة حرارة الغرفة. ثم يتم تحضين العينات في الظلام لمدة ثلاث ساعات وبدون تحريك.اتبع إضافة الجسم المضاد الثانوي بثلاث عمليات غسل في PBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة إذا كان ذلك مناسباً. قم بإجراء صبغ تبايني للخلية، فعلى سبيل المثال، يمكن صبغ النوى من خلال التحضين لمدة 10 دقائق في DPI مخفف بـ PBS. بعد ذلك، ضع العينات في وسط التثبيت لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.لتثبيت العينات، أمسك كل محفظة حدقة من الجهة الأمامية، مع تجنب لمس غشاء الحدقة الداخلي باستخدام زوج ثانٍ من الملاقط. ثم أمسك غشاء الحدقة الداخلي برفق من الرأس، واسحب العينة بلطف من محفظة الحدقة.انقل عينة unca إلى شريحة ذات تجويف تحتوي على 75 إلى 100 µL من وسط التثبيت. يمكن تثبيت عدة عينات على شريحة واحدة. الآن استخدم مسباراً وملقطاً لتوزيع العينات بشكل منتظم داخل التجويف.سنقوم بتدويرها بحيث تواجه أسطحها الجانبية الأعلى، ونزيل أي فقاعات هوائية باستخدام مسبار. وأخيراً، يتم إنزال غطاء الشريحة برفق فوق العينات دون إدخال فقاعات هوائية في هذا التحضير. وسيكون مجهر الإضاءة المهيكلة قابلاً للمقارنة مع تقنيات المجهر البؤري.هذا عرض إسقاطي لـ 50 صورة مجهرية بؤرية (confocal) بفاصل 2.5 microns بين المقاطع. النسيج في مرحلة 26 ساعة من PF، ويظهر التلوين نمط تعبير بروتين wingless وبروتين GFP الذي يحفزه grail بالإضافة إلى النوى. يقع الجانب الأمامي جهة اليسار والميزات الظهرية في أعلى الشاشة.يوضح هذا المقطع كيفية الحفاظ على المورفولوجيا العامة للعينات من خلال هذا الإجراء، مما يسمح بإعادة بناء ثلاثية الأبعاد لمجموعات الصور. يمكن تثبيت عدة عشرات من حدقات العين ووضعها في محلول التثبيت في أقل من 30 دقيقة.علاوة على ذلك، فإن العينات التي يتم تحضيرها باستخدام هذا البروتوكول قابلة لإجراء التهجين، مما يجعل هذا البروتوكول ذا قيمة عالية لدراسات التعبير الجيني.

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا البروتوكول يوضح كيفية تنفيذ المناعية على يرقة ذبابة الفاكهة تشريح.

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; شبكية العين

الهياكل البالغة لذبابة الفاكهة مشتقة من هياكل تشبه الكيس تسمى الأقراص الخيالية. يوفر تحليل هذه الأقراص نظرة ثاقبة للعديد من العمليات التنموية بما في ذلك تحديد الأنسجة ، وإنشاء حدود المقصورة ، وتكاثر الخلايا ، ومواصفات مصير الخلية ، وقطبية الخلية المستوية. يستخدم هذا البروتوكول لإعداد أقراص خيالية للفحص المجهري الضوئي / الفلوري.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من ذبابة الفاكهة السوداء البطن

الهدف من هذه التقنية هو تمكين الباحثين من إجراء تشريح وتلطيخ مناعي وتركيب أقراص عين العذراء من ذبابة الفاكهة السوداء في أي عمر.

تشريح وتركيب<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء أقراص العين

يتم تقديم بروتوكول للتلوين المناعي الكامل على أجنة المن ، حيث يتم معالجة الظروف الحرجة لتقليل تلطيخ الخلفية وزيادة نفاذية الأنسجة. تم تطوير هذه الشروط خصيصا للكشف الفعال عن التعبير البروتيني في الأنسجة الجنينية لحشرات المن.

تحديد الظروف الحرجة لالمناعية في البازلاء المن الأجنة: زيادة نفاذية الأنسجة وتقليل خلفية تلطيخ

القدرة على الكشف عن دقة النصوص أو البروتينات في الأنسجة المورفولوجية أمر بالغ الأهمية لدراسة ما وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية. هنا هو وصف لإجراءات واضحة تشريح أجنحة الخوادر. يمكن استخدام هذه الأجنحة كعينات في العديد من التقنيات (إيمونوهيستوتشيميستري، وفحص PCR، إلخ).

طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

والمبيض المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية المتخصصة التنمية. ولو تم نشر أساليب لتشريح المبايض اليرقات والكبار، تتطلب تشريح المبيض الخوادر التقنيات المختلفة التي لم تنشر بالتفصيل. هنا أننا مخطط بروتوكول لتشريح وتلطيخ، وتصاعد المبايض الخوادر.

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

وتعرض هذه الورقة طريقة جراحية لتشريح المورفولوجية شبكية العين الخوادر جنبا إلى جنب مع بروتوكولات لمعالجة الأنسجة إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، واستخراج الحمض النووي الريبي.

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

ويفصل هذا البروتوكول إعداد وتصور الأنسجة الثابتة لعذراء ذبابة الفاكهة (Drosophila pupal notum). يمكن استخدامه إما للأنسجة السليمة أو المصابة ، ويتم الحفاظ على البنية الأصلية للأنسجة. يتم وصف جميع إجراءات التشريح والتثبيت والتلطيخ في هذه المقالة.

تشريح وإصلاح وتصور ذبابة الفاكهة العذراء Notum

ذبابة الفاكهة هو نموذج قوي لفهم الآليات الأساسية لتكوين العضلات. يتيح هذا البروتوكول الخاص بتشريح وتحضير المقاطع النصفية للصدر التحليل المجهري لعضلات الطيران غير المباشرة من مرحلتي العذراء والبالغين. يتيح هذا البروتوكول التصوير متحد البؤر للتشكل الخلوي ، وتوطين البروتين ، وبنية العضلات ، وجوانب أخرى متعددة من تكوين العضلات.

تشريح ذبابة الفاكهة سوداء الجلد عضلات الطيران غير المباشرة لنهج الفحص المجهري

تعلم تقنية تشريح وصبغ ظهارة بطن يرقات ذبابة الفاكهة للمناعة النسيجية. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة التشكل الظهاري وإعادة تنظيم الأنسجة في علم الأحياء التنموي.

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

استكشف المزيد من الفيديوهات