تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد كمية تجديد وتعبئة تجمعات الحويصلات المشبكية المحددة في الأطراف العصبية المركزية باستخدام تقنيات التصوير الفلوري الحي. يتم تحقيق ذلك من خلال مراقبة جولتين من إعادة تدوير الحويصلة المشبكية ، باستخدام أصباغ FM في نفس الأطراف العصبية لتوفير ضوابط داخلية صالحة. كخطوة ثانية ، يتم استنفاد المجمع القابل للتحرير بسهولة والمجمع الاحتياطي بالتتابع باستخدام بروتوكولات تفريغ محددة ، والتي تسمح بالقياس الكمي لأحجام التجمع النسبية.

بعد ذلك ، قم بتغيير ظروف التحميل أو التفريغ من أجل دراسة تأثير التباين المختار على الحويصلة المشبكية أو تجديد التجمع أو التعبئة. تظهر النتائج أن تحميل FM d لتجمعات فيزيائية متشابكة مختلفة قابل للتكرار بناء على القياس الكمي وتحليل تفريغ الصبغة المستحثة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل عائلة المراسلين الوراثيين بطلاقة ، هي أن هذه التقنية تتعقب تجديد التجمعات على وجه التحديد بواسطة الحويصلات المشبكية ، التي خضعت للالتقام الخلوي.

كما يسمح بالقياس الكمي الدقيق. نظرا لأن هذا البروتوكول يتم تنفيذه مرتين في نفس الأطراف العصبية التي توفر تحكما داخليا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الالتقام المشبكي ، CLE ، الالتقام الخلوي ، وإفراز القام الخلوي ، مثل كيف يمكن أن يؤثر التلاعب في أوضاع الالتقام الخلوي المحددة على تجديد كل من تجمع إعادة التدوير الكلي وتجمعات CLE المشبكية بداخله ، مثل التجمع القابل لإعادة الاستخدام بسهولة وتجمع الاحتياطي.

يجب أن يتكون الإعداد التجريبي الأساسي من مجهر مضان epi مقلوب ، وكاميرا CCD مبردة ، ومصدر ضوء فلوري ، وجهاز نضح الجاذبية ، وغرفة تصوير مع أقطاب كهربائية بلاتينية متوازية ومحفز كهربائي وجهاز كمبيوتر. قم بإجراء التجارب في الظلام أو تحت ظروف الضوء الأحمر مع الحد الأدنى من إضاءة الفلورسنت للعينة لتجنب تبييض صبغة FM. ابدأ هذا الإجراء باستخدام صغار جرذ سبرا دوللي البالغة من العمر سبعة أيام لإعداد الثقافات الأولية للخلايا العصبية الحبيبية المخيخية.

بعد إعداد الثقافات ، قم بوضع الخلايا العصبية الموجودة في وسط زلة غطاء بولي دي ليسين مطلية بطول 25 ملم في قطرة ، لا يتجاوز قطرها سبعة ملليمترات بعد ساعة واحدة ، أضف ملليلترين من وسائط الثقافة إلى الخلايا العصبية بعد سبعة أيام. ضع غطاء واحد في المحلول الملحي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح بالثبات في الوسط الجديد. بعد ذلك ، قم بإزالة زلة الغطاء ، وجفف جانبها السفلي ، والمنطقة المحيطة بالخلايا المرفقة بقطعة صغيرة من المناديل الورقية أو الورق الماص.

بعد ذلك ، استخدم شحم السيليكون للصق زلة الغطاء في الجزء السفلي من غرفة التصوير. يجب أن تكون الخلايا بين السلكين المتوازيين. استخدم شحم سيليكون كاف لإغلاق الغرفة تماما دون التعدي على وسط حجرة الحمام.

بعد ذلك ، املأ حجرة الحمام برفق بحوالي 260 ميكرولتر محلول ملحي. ثم املأ أنبوب الإدخال والإخراج بنفس المحلول. أغلق الغرفة عن طريق لصق زلة غطاء نظيفة بشحم السيليكون إلى الأعلى.

بعد ذلك ، قم بإزالة أي فقاعات هواء محاصرة في الغرفة باستخدام أنبوب الإدخال والإخراج. ثم قم بتثبيت غرفة التصوير في منصة من الفولاذ المقاوم للصدأ. تحقق من عدم وجود تسرب عن طريق استخدام المحلول الملحي برفق من خلال أنبوب الإدخال.

الخطوة التالية هي تركيب الغرفة المجمعة على مسرح المجهر المقلوب. قم بتجهيز مدخل نظام التروية بالجاذبية بمحلول ملحي وقم بتوصيل الغرفة بالمدخل. ثم قم بتوصيل أسلاك التوصيل الخاصة بالغرفة بالمحفز الكهربائي.

قم بتبريد الخلايا العصبية ب 1.5 مل من صبغة fm المخففة. بعد ذلك تحفيز الخلايا العصبية باستخدام المحفز المرفق لاستحضار امتصاص الصبغة بعد التحفيز ، قم بتفريم الخلايا العصبية بمحلول ملحي طازج لمدة دقيقتين لغسل صبغة FM الزائدة. ثم احتفظ بالخلايا العصبية في المحلول الملحي لمدة ثماني دقائق.

في غضون ذلك ، حدد موقع الشبكات المحورية حيث تكون الأطراف العصبية المحملة FM D مرئية. باستخدام الأطوال الموجية للفلورسين. تجنب المناطق التي بها مجموعات من الخلايا.

ثم أعد تركيز الصورة مباشرة قبل الحصول على الصورة حيث قد يكون قد حدث انجراف طفيف خلال فترة الراحة. ابدأ الحصول على الصور بفاصل زمني بمعدل إطار واحد كل أربع ثوان. بعد الحصول على خمس إلى 10 صور أساسية تثير إفراز الخلايا للتجمع الذي يمكن إطلاقه بسهولة عن طريق تقديم تحفيز 30 هرتز لمدة ثانيتين.

بعد الحصول على 10 صور أخرى ، استحضار الحويصلة المشبكية ، وخروج الخلايا من تجمع الاحتياطي باستخدام ثلاثة محفزات من 40 هرتز لمدة 10 ثوان مع فاصل زمني 40 ثانية بين التحفيز ، والحصول على خمس إلى 10 صور أخرى. ثم أوقف الحصول على الصورة مؤقتا. اسمح للخلايا العصبية بالتعافي لمدة 20 دقيقة على الأقل ، وكرر بروتوكول S أحادي الطور مرة أخرى في المرحلة الثانية لتجربة التحكم.

لتحليل البيانات، قم بتحويل الصور إلى مكدس. باستخدام وظيفة الصورة J المضمنة، ثم اضبط سطوع المكدس وتباينه لزيادة النطاق الديناميكي إلى أقصى حد في حالة حدوث انحراف أفقي كبير. أثناء التجربة، قم بتشغيل المكونات الإضافية stack reg و turbo reg على الصورة J لمحاذاة مكدس الصور.

ثم البرنامج المساعد محلل سلسلة runtime. بعد ذلك ، حدد مناطق الاهتمام على الأقل 90 محطة عصبية. من المفيد التبديل بين الصور قبل وبعد تفريغ القالب للكشف عن الأطراف العصبية النشطة.

المنطقة المثالية ذات الحجم المطلوب هي تلك التي تكون أكبر قليلا من الطرف العصبي النموذجي. ثم احصل على شدة التألق الإجمالية لكل منطقة ذات أهمية بمرور الوقت. بعد ذلك ، قم بالتصدير إلى Microsoft Excel.

يظهر هنا مخطط انسيابي لتجربة تحكم حيث تم تحميل الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية ب 10 ميكرومولار FM 1 43 باستخدام تحفيز 80 هرتز و 10 ثوان. فيما يلي صورة تظهر الأطراف العصبية المحملة ب FM 1 43. فيما يلي نفس الصورة التي تظهر 90 منطقة مرقمة ذات أهمية تم اختيارها للتحليل بعد تحديد الأطراف العصبية النشطة ، وهذه هي صور الأطراف العصبية في نقاط زمنية محددة.

يتم تقديم هذه الصور بألوان زائفة لتوضيح التغيرات في التألق حيث تم استنفاد أحواض الحويصلة المشبكية المختلفة. أخيرا ، تظهر هنا وحدات الفلورسنت الطبيعية لهذه المحطات العصبية ال 90. في مرحلتين S one و S ، يمكن قياس انخفاض التألق لكل تحفيز متسلسل ومقارنته بين مرحلتين S واحد و S.

في تجربة التحكم هذه ، نتج عن كل من S واحد و S اثنين نفس أحجام الأحواض الاحتياطية التي يمكن إطلاقها بسهولة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تجديد وتعبئة أحواض حويصلات متشابكة محددة في الأطراف العصبية المركزية باستخدام تقنيات التصوير الفلوري للحياة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تأكيد صلاحية الخلية واستجابتها من خلال إجراء تجارب التحكم S one قبل تغيير الشروط التجريبية S الثانية.