تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس كمية تجديد وتعبئة أحواض الحويصلات التشابكية المحددة في النهايات العصبية المركزية باستخدام تقنيات التصوير الفلوري الحي. ويتم تحقيق ذلك من خلال مراقبة جولتين من إعادة تدوير الحويصلات التشابكية، باستخدام صبغات FM في النهايات العصبية نفسها لتوفير ضوابط داخلية صالحة. وكخطوة ثانية، يتم استنفاد الحوض القابل للإطلاق بسرعة والحوض الاحتياطي بالتتابع باستخدام بروتوكولات تفريغ محددة، مما يسمح بقياس أحجام الأحواض النسبية.

بعد ذلك، قم بتغيير ظروف التحميل أو التفريغ لدراسة تأثير التباين المختار على كل من الحويصلات التشابكية، أو تعويض المجموعات، أو التعبئة. وتظهر النتائج أن تحميل FM d في المجموعات الفيزيائية التشابكية المختلفة قابل للتكرار بناءً على كمية وتحليل تفريغ الصبغة المستحث. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل عائلة المراسلين الجينيين الفلوريين، في أن هذه التقنية تتبع تعويض المجموعات تحديداً بواسطة الحويصلات التشابكية التي خضعت لعملية الالتقام الخلوي.

كما تتيح هذه الطريقة قياساً كمياً دقيقاً، وبما أن هذا البروتوكول يُنفذ مرتين في نفس النهايات العصبية، فإنه يوفر تحكماً داخلياً. ويمكن أن يساعد هذا الأسلوب في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات التشابك العصبي، وCLE، والالتقام الخلوي، والإخراج الخلوي، مثل كيفية تأثير التلاعب في أنماط محددة من الالتقام الخلوي على تعويض كل من مجمع التدوير الكلي ومجمعات CLE التشابكية بداخله، مثل المجمع القابل للاستخدام الفوري والمجمع الاحتياطي.

يجب أن يتكون الإعداد التجريبي الأساسي من مجهر فلوري انعكاسي مقلوب، وكاميرا CCD مبردة، ومصدر ضوء فلوري، وجهاز تروية بالجاذبية، وغرفة تصوير مزودة بأقطاب بلاتينية متوازية ومحفز كهربائي، وجهاز كمبيوتر. تُجرى التجارب في الظلام أو تحت ظروف الضوء الأحمر مع الحد الأدنى من الإضاءة الفلورية للعينة لتجنب تبييض صبغة FM. ابدأ هذا الإجراء باستخدام صغار جرذان spra dolly بعمر سبعة أيام لتحضير المزارع الأولية للعصبونات الحبيبية المخيخية.

بعد تحضير المزارع، يتم وضع الخلايا العصبية في مركز شريحة غطاء قطرها 25 مليمتر مغطاة بـ poly D lysine على شكل قطرة، بحيث لا يتجاوز قطرها سبعة مليمترات. بعد مرور ساعة واحدة، أضف 2 مل من وسط الاستزراع إلى الخلايا العصبية. وبعد سبعة أيام، ضع شريحة غطاء واحدة في محلول ملحي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح بالاستقرار في الوسط الجديد. بعد ذلك، أخرج شريحة الغطاء، وجفف جانبها السفلي والمنطقة المحيطة بالخلايا الملتصقة باستخدام قطعة صغيرة من المناديل الورقية أو ورق ماص.

بعد ذلك، استخدم الشحم السيليكوني للصق شريحة الغطاء بقاع غرفة التصوير. يجب أن تكون الخلايا بين السلكين المتوازيين. استخدم كمية كافية من الشحم السيليكوني لإغلاق الغرفة تماماً دون أن يتجاوز ذلك إلى مركز غرفة الحمام.

بعد ذلك، املأ غرفة الحمام برفق بنحو 260 µL من المحلول الملحي. ثم املأ أنابيب الإدخال والإخراج بالمحلول نفسه. أحكم إغلاق الغرفة عن طريق لصق غطاء زجاجي نظيف باستخدام الشحم السيليكوني في الأعلى.

بعد ذلك، قم بإزالة أي فقاعات هواء محتبسة في الحجرة باستخدام أنابيب الإدخال والإخراج. ثم قم بتثبيت حجرة التصوير في منصة من الفولاذ المقاوم للصدأ. تحقق من عدم وجود تسريبات عن طريق تمرير محلول ملحي بلطف عبر أنبوب الإدخال.

تتمثل الخطوة التالية في تثبيت الحجرة المجمعة على منصة مجهر مقلوب. قم بتعبئة مدخل نظام التروية بالجاذبية بمحلول ملحي ثم صِل الحجرة بالمدخل. بعد ذلك، صِل أسلاك التوصيل الخاصة بالحجرة بالمحفز الكهربائي.

قم بتروية العصبونات بـ 1.5 milliliters من صبغة fm المخففة. بعد ذلك، قم بتحفيز العصبونات باستخدام المحفز الملحق لإثارة عملية امتصاص الصبغة. وبعد التحفيز، قم بتروية العصبونات بمحلول ملحي طازج لمدة دقيقتين لغسل صبغة FM الزائدة. ثم احتفظ بالعصبونات في المحلول الملحي لمدة ثماني دقائق.

وفي هذه الأثناء، حدد مواقع الشبكات المحورية التي تظهر فيها النهايات العصبية المحملة بـ FM D بشكل فردي. استخدم الأطوال الموجية للفلورسين. وتجنب المناطق التي تحتوي على تجمعات خلوية.

بعد ذلك، قم بإعادة تركيز الصورة فوراً قبل عملية الالتقاط، حيث قد يحدث انزياح طفيف خلال فترة الراحة. ابدأ التقاط الصور بنظام التصوير الزمني (time-lapse) بمعدل إطار واحد كل أربع ثوانٍ. وبعد التقاط من 5 إلى 10 صور أساسية، قم بتحفيز عملية الإخراج الخلوي (exocytosis) للمخزون الجاهز للتحرر (readily releasable pool) عن طريق إرسال تحفيز بتردد 30 hertz لمدة ثانيتين.

بعد الحصول على 10 صور أخرى، قم بتحفيز الإفراز الخلوي للحويصلات التشابكية من المجمّع الاحتياطي باستخدام ثلاث عمليات تحفيز بتردد 40 هرتز لمدة 10 ثوانٍ وبفاصل 40 ثانية بين عمليات التحفيز، ثم احصل على خمس إلى 10 صور أخرى. بعد ذلك، أوقف عملية الحصول على الصور مؤقتاً. اترك العصبونات لتتعافى لمدة 20 دقيقة على الأقل، ثم كرر بروتوكول المرحلة S one هذا مرة أخرى في المرحلة S two من أجل تجربة الضبط.

لتحليل البيانات، قم بتحويل الصور إلى مكدس (stack). باستخدام دالة مدمجة في برنامج Image J، قم بضبط السطوع والتباين للمكدس لزيادة المدى الديناميكي إلى أقصى حد في حال حدوث انزياح أفقي ملحوظ. أثناء التجربة، قم بتشغيل إضافتي stack reg و turbo reg في برنامج Image J لمحاذاة مكدس الصور.

بعد ذلك، استخدم ملحق محلل السلاسل الزمنية (runtime series analyzer plugin). ثم، حدد مناطق الاهتمام في 90 من النهايات العصبية على الأقل. ومن المفيد التبديل بين الصور قبل وبعد تفريغ الصبغة للكشف عن النهايات العصبية النشطة.

يكون حجم منطقة الاهتمام المثالي أكبر قليلاً من الحجم النموذجي للنهاية العصبية. ثم يتم الحصول على إجمالي شدة الفلورة لكل منطقة اهتمام بمرور الوقت. بعد ذلك، يتم تصدير البيانات إلى برنامج Microsoft Excel.

يظهر هنا مخطط تدفقي لتجربة ضابطة حيث تم تحميل العصبونات الحبيبية المخيخية بـ 10 µM من صبغة FM 1 43 باستخدام تحفيز بتردد 80 Hz لمدة 10 s. وهذه صورة تظهر النهايات العصبية المحملة بـ FM 1 43. وهنا تظهر الصورة نفسها مع تحديد 90 منطقة اهتمام مرقمة تم اختيارها للتحليل بعد تحديد النهايات العصبية النشطة، وهذه هي صور النهايات العصبية عند نقاط زمنية مختارة.

تُعرض هذه الصور بالألوان الزائفة لتوضيح التغيرات في الفلورة مع استنزاف المجموعات المختلفة للحويصلات التشابكية. وأخيراً، تظهر هنا وحدات الفلورة المعيارية لهذه النهايات العصبية التسعون. في مرحلتي S one وS two، يمكن قياس انخفاض الفلورة لكل تحفيز متتالي ومقارنته بين مرحلتي S one وS two.

في هذه التجربة الضابطة، أدى كل من S one وS two إلى الحصول على الأحجام نفسها من الأحواض القابلة للإطلاق السريع وأحواض الاحتياطي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس تعويض وتعبئة أحواض حويصلات مشبكية محددة في النهايات العصبية المركزية باستخدام تقنيات التصوير الفلوري الحي. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تأكيد حيوية الخلايا واستجابتها من خلال إجراء تجارب S one الضابطة قبل تغيير الظروف التجريبية لـ S two.