والفحص الكمية للأنسولين ، معربا عن الأسلاف لتشكيل مستعمرة

يوضح هذا الفيديو إجراءً لإنشاء مستنبتات ثلاثية الأبعاد تسمح للخلايا السلفية الشبيهة بالبنكرياس بالتمايز إلى مستعمرات تعبر عن الإنسولين. أولاً، يتم تفريق الخلايا المتمايزة المشتقة من خط خلايا جذعية جنينية فئرانية من نوع neurogen in three EGFP Knockin، ثم يتم فرزها بناءً على تعبير EGFP لإثراء الخلايا السلفية الشبيهة بالغدد الصماء. بعد ذلك، تُزرع الخلايا المفردة المفرزة والموجبة لـ EGFP في وسط شبه صلب يحتوي على matrigel وعوامل نمو.

يحد هذا من حركة الخلايا السليفة الفردية مع السماح ببقائها وتكاثرها وتمايزها في المختبر (in vitro). بعد ذلك، يتم حساب وتقدير عدد المستعمرات الناتجة ذات المورفولوجيا المميزة تحت المجهر، وذلك لحساب تردد الخلايا السليفة المكونة للمستعمرات في مجموعة فرعية محددة تم فرزها. ويكشف تحليل المستعمرات الفردية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) ومجهر الفلورة المناعية عن تعبير الإنسولين في المستعمرات المشتقة من الخلايا الموجبة لـ ngn three، ولكن ليس من الخلايا السالبة لـ NGN three.

تكمن الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنةً بالتقنيات الحالية، مثل استزراع الكريات البنكرياسية في المزارع المعلقة، في أنها تتيح فحص كمية أكبر من الخلايا في آن واحد لتقييم قدرتها الجوهرية على تكوين مستعمرات سلفية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على تساؤلات تتعلق ببيولوجيا الخلايا الجذعية والسلفية البنكرياسية، مثل تحديد الواسمات التي تعبر عنها الخلايا السلفية، ومعرفة العوامل الجوهرية أو الخارجية المهمة للحفاظ على هذه الخلايا وتجددها الذاتي وتمايزها. ويمكن أن تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج داء السكري من النوع الأول؛ لأنه إذا أمكن تحديد الخلايا السلفية البنكرياسية وتوجيه تمايزها نحو خلايا شبيهة بخلايا بيتا، فيمكن حينئذٍ استخدام تلك الخلايا لاستبدال خلايا بيتا التالفة لدى المرضى الذين يعانون من المراحل النهائية من داء السكري من النوع الأول.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمة أخرى، مثل دراسة الخلايا السلفية المكونة للمستعمرات في البنكرياس بعد الولادة وفي مرحلة البلوغ، ونخاع العظم، والكبد، والطحال. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه التقنية بعض الصعوبات، لأن تفكيك الخلايا إلى معلق خلوي أحادي والتعامل مع الـ matrigel والـ methylcellulose أثناء التحضير للتوزيع قد يكون أمراً صعباً. لقد طرأت لي فكرة هذه الطريقة عندما أدركت عدم وجود مقايسة لتكوين المستعمرات (clon genic assay) لمعالجة العلاقة السلالية بين الخلايا السلفية وسلالاتها المتمايزة من البنكرياس.

لقد كان مقايسة المستعمرات هذه أساسية لدراسة الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية في الماضي. وأدرك وجود حاجة لمثل هذه المقايسة لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية البنكرياسية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن مكون الوسط شبه الصلب لزج بطبيعته، كما أن خطوات التحضير والتوزيع يصعب تعلمها.

سيقوم بعرض الإجراءات كل من السيد مايكل وينكلر، طالب ماجستير، والآنسة نانسي، فنية مختبر، والدكتور لانغ جينغ، زميل ما بعد الدكتوراه من المختبر، وذلك لتحضير وسط مكيف لاختبار المستعمرات الذي سيتم إجراؤه لاحقاً. يتم تمايز خلايا Neuron ES إلى خلايا شبيهة بالبنكرياس في المختبر (in vitro). ابدأ هذا الإجراء بفحص أجسام أجنة عمرها ستة أيام تحت المجهر الضوئي.

يجب أن يكون قطر 30 إلى 40% منهم على الأقل 150 microns. وينبغي أن يحتوي جسم الجنين الأكبر على بقع داكنة تشير إلى تمايز معزز. انقل من 80 إلى 100 من أجسام الأجنة إلى كل بئر في لوحة التصاق ذات ستة آبار، ثم قم بهز اللوحة برفق لتجميع أجسام الأجنة في مراكز الآبار لزيادة الاتصالات بين الخلايا.

تؤدي هذه الملامسات إلى تطوير أفضل لخلايا شبيهة بخلايا البنكرياس من الأجسام الجنينية. ضع الأطباق برفق مرة أخرى في الحاضنة عند 37 °C و5% carbon dioxide في الوسط الزرعي. A 13.

استبدل الوسط بوسط استزراع ملتصق جديد يحتوي على nicotinamide و human recombinant active in beta B لتحفيز تمايز الخلايا الصماء. ثم أعد المزارع إلى الحاضنة للاستزراع. في اليوم 16، اجمع الوسط وقم بترشيحه عبر غشاء من polyethers sulfate بمسامية 0.2 micron للتخلص من أي حطام خلوي.

من هذه النقطة فصاعداً، سيُشار إلى الوسط المجمّع باسم الوسط المكيّف. يتم تقسيم الوسط المكيّف إلى أنابيب بولي بروبيلين مخروطية سعة 15 milliliter وتُخزن عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius حتى وقت الاستخدام مباشرة. يُعد neurogen in three عامل نسخ يتم التعبير عنه بواسطة السلائف الغدية البنكرياسية أثناء التطور. وتتمايز السلائف الغدية التي تعبر عن neurogen in three في النهاية إلى خلايا تعبر عن البوليببتيد البنكرياسي، وخلايا ألفا، وبيتا، ودلتا، وإبسيلون البنكرياسية. ولتسهيل تحديد الخلايا التي تعبر عن NG N three، تم استبدال أليل واحد من موقع NNG N three بجين المراسل EGFP في خط خلايا جنينية فأرية (ES cell line) معدلة وراثياً. وقد سُمي خط الخلايا الناتج NGN three EGFP للحصول على خلايا متمايزة موجبة لـ NGN three EGFP وخلايا سالبة لـ NGN three EEG FP.

يتم أولاً فصل الخلايا من أطباق الزرع باستخدام التربسين في اليوم 16 لإنتاج معلق من الخلايا المفردة. تُحضن تكتلات الخلايا مع collagenase B و DNAs 1 ثم تُمَرر عبر مشبك بمسام مقاس 40 أو 70 ميكرون. بعد ذلك، يُضاف DPI وتُفرز الخلايا باستخدام جهاز فرز الخلايا لفرز التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي، واللذين يشيران إلى حجم الخلايا وحبيبيتها على التوالي، ويتم رسمهما بيانياً.

يتم بعد ذلك رسم بوابة لاستبعاد الحطام غير الخلوي. ويُستخدم DPI لتمييز الخلايا الميتة، والتي ستظهر صبغتُها إيجابية. وعندما يتم الاستثارة عند 405 إلى 413 نانومتر ويتم اكتشاف الانبعاث باستخدام مرشح 454 40، فإن تحديد بوابة عرض النبضة (pulse width)، وهو عرض نبضة التشتت الأمامي الإلكتروني، يكشف عن المزدوجات (doublets)، والتي يجب استبعادها قبل تمريرها عبر جهاز فرز الخلايا المنشط فلورياً من خلال تحديد بوابة قناة EGFP FL one مقابل الفلورة الذاتية.

باستخدام خلايا من اليوم 16 لخط خلوي أبوي ضابط، مثل TL الموضح في اللوحة اليسرى التي تظهر الفلورة الحقيقية، وبالتالي يمكن تصور مجموعة الخلايا الموجبة لـ NGN three EEG FP كما هو موضح في اللوحة اليمنى. يتم تحريك بوابة فرز الخلايا الموجبة لـ NGN three EGFP عمداً نحو اليمين كما يشير السهم هنا، وذلك للحد من تلوث الخلايا السالبة لـ NG N three EEG FP أثناء عملية الفرز. وبمجرد تحديد البوابات، يتم فرز الخلايا الموجبة لـ NGN three EEG, FP والخلايا السالبة لـ NGN three EGFP وتخزينها على الثلج حتى وقت استخدامها في التحضير للزراعة.

ضع الـ matri gel على الثلج عند درجة حرارة 4 °C في الليلة السابقة للتجربة. أما في يوم التجربة، فضع الكواشف أو المحاليل التالية على الثلج: D-M-E-M-F 12، وmethyl cellulose، والوسط المكيف (conditioned media)، وFCS، وnicotinamide، وXTEND in four، وVEGF A، وrecombinant human active in beta B. ضع صندوقاً معقماً من رؤوس الماصات سعة 200 µL عند درجة حرارة -20 °C قبل الاستخدام بنصف ساعة على الأقل. تحضيراً لزراعة الخلايا المفروزة، يجب أولاً إضافة مكونات الوسط شبه الصلب إلى أنبوب بوليسترين سعة 5 mL. أولاً، استخدم إبرة مقاس 16.5 gauge لسحب كمية صغيرة من محلول 3.3% methyl cellose إلى حقنة.

ثم ادفع المحلول فوراً لإخراج الهواء، حيث سيؤدي ذلك إلى ملء الحيز الميت في المحقنة بالمحلول وتسهيل القياس الدقيق لحجم المحلول شبه الصلب. بعد ذلك، وبدون تكوين فقاعات هوائية، اسحب الحجم المطلوب من محلول ميثيل السليلوز وانقله إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر.

أضف الوسط المكيف الذي يحتوي على FCS والنيكوتيناميد والـ VEGF A و D-M-E-M-F 12. ثم استخدم رؤوس ماصات باردة لإضافة الماتريجيل (matrigel). وأخيراً، أضف الكمية المطلوبة من الخلايا المفرزة في أنبوب سعة 5 mL.

أضف الخلايا دائماً في النهاية لتجنب التحفيز المبكر للخلايا. بعد ذلك، أغلق الأنبوب بإحكام ورج الأنابيب بقوة وبشكل شامل يدوياً. ونظراً لأن الرج يؤدي إلى تكوين فقاعات هوائية، ضع الأنابيب على الثلج لمدة خمس دقائق أو حتى تطفو الفقاعات الهوائية الصغيرة على السطح.

باستخدام حقنة سعة 1 مل مع إبرة قياس 18.5، اسحب كمية صغيرة من خليط الخلايا في الوسط شبه الصلب، ثم قم بطرد الهواء من الحقنة على الفور. بعد ذلك، قم بتوزيع 500 µL من خليط الخلايا شبه الصلب ببطء مباشرة في مركز كل بئر من آبار لوح 24 بئر منخفض الالتصاق. يجب زراعة كل عينة في أربع مكررات، مع استخدام الأعمدة الأربعة الداخلية فقط في لوح 24 بئر الموجه أفقياً لأغراض الاستنبات.

املأ الآبار المتبقية بالماء المعقم للمساعدة في ترطيب الوسط الذي يحتوي على المزارع الخلوية. بعد عملية الزرع مباشرة، افحص الخلايا تحت المجهر الضوئي.

تتوزع الخلايا المفردة بشكل عشوائي ومتساوٍ في جميع الآبار. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C وفي هواء يحتوي على 5% carbon dioxide لمدة تتراوح من 8 إلى 12 يوماً. وبعد التحضين لمدة 8 إلى 12 يوماً، تُفحص الخلايا مرة أخرى تحت المجهر.

يعد هذا مثالاً جيداً على توزيع متساوٍ للـ matrigel في المزرعة الخلوية. وهنا مثال على توزيع غير متساوٍ للـ matrigel مما أدى إلى ظهور إطار Apache. لا تنمو المستعمرات في المناطق التي يغيب فيها الـ matrigel.

هذا مثال لخلفية البئر حيث لم يتم إضافة matri gel إلى خليط الوسط شبه الصلب. ولعد المستعمرات الناتجة، قم بتثبيت شبكة أسفل الطبق. ثم باستخدام عدسة شيئية بقوة 10 مرات، قم بملاحظة وعد المستعمرات؛ ونظراً للطبيعة ثلاثية الأبعاد للوسط، ستظهر المستعمرات في نقاط بؤرية مختلفة.

وبالتالي، قد يتطلب الأمر ضبط التركيز لكل مستعمرة أثناء الفحص بالمجهر الضوئي؛ وتظهر هنا صور مجهرية ممثلة للمستعمرات التي تعبر عن الإنسولين في مستنبت شبه صلب بعد مرور ثمانية إلى 12 يوماً، حيث تتوزع المستعمرات المشار إليها بالأسهم بشكل عشوائي وتظهر على شكل تجمعات صغيرة داكنة وغير عاكسة للضوء بقطر يتراوح تقريباً بين 60 إلى 100 ميكرون. وقد كشف تحليل R-T-P-C-R باستخدام الموائع الدقيقة للمستعمرات التي تم اختيارها يدوياً وبشكل فردي عن تعبير عن الإنسولين 2 والجلوكاجون بما يتوافق مع تقريرنا السابق. وتثبت هذه النتائج قدرة الخلايا المفردة NGN three EGFP الموجبة على التمايز إلى مستعمرات تحتوي على هرمونين من هرمونات الجزر البنكرياسية في آن واحد، مما يشبه الخلايا الصماء الأولية الشبيهة بالموجة الأولى، وقد تم تأكيد التعبير البروتيني لـ eptide، وهو مؤشر على إنتاج الإنسولين من جديد، باستخدام صبغ الفلورسنت للعينات الكاملة.

باختصار، عند إجراء مقايسة وحدات تشكيل المستعمرات المعبرة عن الإنسولين كما هو موضح في هذا التقرير، يمكن تحديد عدد السلائف الفردية التي تمتلك القدرة على تشكيل المستعمرات بسهولة؛ وكما تم توضيحه هنا وفي تقريرنا السابق، يمكن إثراء وحدات تشكيل المستعمرات المعبرة عن الإنسولين عن طريق فرز الخلايا الموجبة لـ NGN EGFP، وليس الخلايا السالبة لـ ngn three EEG FP المشتقة من خلايا rine ES في المختبر. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة إلى ثلاث ساعات بعد الفرز. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تفكيك الخلايا تماماً إلى معلق خلوي أحادي، والحفاظ على جميع مكونات المزرعة على الثلج لتجنب تصلب matrigel، وإضافة الخلايا إلى الأنابيب في النهاية لتجنب التحفيز المبكر للخلايا. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المعالجة الخلوية الفردية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كانت خلية واحدة كافية لبدء تكوين المستعمرات بعد تطورها.

سوف تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية والسلفية في البنكرياس؛ حيث تتيح لهم استكشاف قدرة التجديد الذاتي وإمكانية التمايز إلى خلايا شبيهة بخلايا بيتا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء مقايسة المستعمرات الكمية للخلايا السلفية المكونة للمستعمرات والمعبرة عن الإنسولين.