Name: برغي دليل بسيط أسلوب للدراسات طعم أجنبي داخل الجمجمة في الفئران (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: تعلم طريقة البرغي الدليل لإنشاء نماذج زرع داخل الجمجمة لأورام الدماغ في الفئران. تُستخدم هذه التقنية لتقييم فعالية العلاجات الجديدة لأورام الدماغ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر Verlene هنري وهولمز ليندساي للمساعدة في تطوير هذا النموذج. وقد تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة جيمس س. ماكدونيل (# 220020173).

1. خطوط خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استزراع خلايا U87MG دبقي قوارير كبيرة في زراعة الأنسجة مع DMEM - F12 تستكمل مع مصل بقري جنيني من 5 ٪ (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم حصاد الخلايا عن طريق غسل القوارير مرتين مع الفوسفات المالحة الدافئة التخزين المؤقت (PBS) وتفرخ لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع 10 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25 ٪ ، والتربسين EDTA 0.05 ٪. حالما يتم رفع الخلايا ، يتم وضعها في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام والثقافة ، وطرد (300 X ز لمدة 4 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل ، ومعلق الخلايا بتركيز 10 × 10 6 / مل في وسائل الإعلام والثقافة ، والتي سمحت لتلقيح خلايا 50000 / 5 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتحفظ الخلايا على الثلج حتى الحقن داخل القحف. </li></ol> 2. دليل المسمار داخل القحف انشقاقه يمكن أن يتم هذا الإجراء إلى عدة أيام قبل حقن الخلايا. وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة هنا تحت ظروف معقمة صارمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران (BALB / ج نو / نو الإناث ؛ 5-6 أسابيع ؛ 18G تقريبا) يتم ترقيم لأغراض تحديد الهوية ، وزنه anesthetised مع حقنة (IP) داخل الصفاق من مزيج من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (5 ملغ / كلغ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومسحت أسفل الجلد بمحلول اليود ، ويتم إجراء شق صغير (2-3 ملم) على طول الجهة اليمنى من خط الوسط الأمامي وحتى خط interaural. الكشف عن خيوط هذه الاكليلية والسهمي من الجمجمة. يتم وضع bregma عند تقاطع هذه الغرز اثنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع علامة على إدخال المسمار دليل نقطة عند نقطة 2.5 مم و 1 مم الوحشي الأمامي للbregma. وتقع هذه النقطة مباشرة فوق نواة المذنب 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن حفر حفرة ل1 × 1 مم عميقة مع يد معقمة عقد حفر تويست من خلال الجمجمة إلى الجافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وانسحب بعد ذلك المسمار دليل المعقمة التي ستمتد 1.6 مم تحت السطح الجماجم في الجافية في الحفرة مع سائق المسمار حتى الاحمرار مع الجمجمة (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك يتم وضع مرود معقمة أو دمية المسمار في حفرة بوسط المسمار دليل لإغلاق الفتحة (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطى إغلاق الجرح مع لاصق الأنسجة Vetbond (ن بوتيل cyanoacrylate) والفئران داخل الصفاق حقنة من reversine (الحيوانات الصغيرة) (0.1 مل / كغ) وكاربروفين (5 mg/kg/100 ميكرولتر) للوعي. ثم يتم السماح الفئران لاسترداد على حصيرة الاحترار (36 درجة مئوية) والذي يمكن أن يستغرق 20 دقيقة. كثيرا ما يتم رصد الفئران والتي لوحظت خلال هذا الوقت حتى يتم استرداد كامل وعيه. </li></ol> 3. engraftment الخلوية داخل القحف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم إعداد محقنة معقمة هاميلتون مكبلة من خلال تطبيق حلقة صغيرة من البلاستيك لطرف الإبرة يسمح سوى 2 ملم من إبرة لتوسيع مخرج المسمار دون دليل (1B الشكل). النقطة الأخيرة هي التلقيح لذا 3.5 ملم تحت سطح الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أربعة أيام بعد جراحة دليل المسمار ، ومرة ​​أخرى تخدير الفئران هي على النحو الوارد أعلاه (2.1) ويتم إجراء شق صغير فوق المسمار دليل لإزالة مرود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم ملء الحقنة هاميلتون معقودة مع 5 ميكرولتر من الخلايا تمتزج جيدا مع الحذر بعدم إنشاء أو وضع أي فقاعات هواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تأمين مضخة محقنة لنضح ويتم إدخال الإبرة في دليل المسمار (الشكل 1C). هي التي غرست ثم الخلايا بمعدل 30 ميكرولتر للساعة الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سمح الجهاز الآلي (1D الشكل) لنا لحقن الحيوانات يصل إلى 10 في وقت واحد في معدل تدفق ثابت. ويمكن أيضا أن حقن الخلايا يدويا باستخدام محقنة هاميلتون مكبلة أو بدلا من الحقنة يمكن مقيد اليدين ، في تلميح 200 ميكرولتر ماصة التي تم قلصت بنسبة 3 ملم لتسمح للطرف إبرة لتتجاوز المسمار دليل بمقدار 2 مم. ثم يجب أن يقوم على حقن بوتيرة مطردة ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال التسريب ، تتم إزالة بعناية المحاقن ويتم استبدال مرود المسمار في الدليل. وأغلقت لاصق الجروح وتعطى الفئران أدوية الانتعاش كما كان من قبل (2.7) ، وسمح لاسترداد على حصيرة الاحتباس الحراري. </li></ol> 4. التحدي العلاجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أربعة أيام من التلقيح U87MG الخلية ، يتم وزن الفئران وقسمت عشوائيا إلى سيطرة الجماعات والعلاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونظرا للسيطرة على المجموعة داخل الصفاق (IP) حقن برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر) ، في حين يتم إعطاء مجموعة العلاج من حقنة IP AMG102 (100 ميكروغرام في 100 ميكرولتر من PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تكرار الحقن كل يوم الثاني على التوالي لمدة 14 يوما ، أي ما مجموعه 6 حقن (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن النهائي ، ويتم رصد الفئران اليومية وزنه كل يوم الثاني على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعندما بدأت الفئران لعرض اختلالات عصبية كبيرة (اضطراب التوازن ، والشلل) ، والجفاف ، أو أكثر من 10 ٪ فقدان الوزن أو المحتضرة ، euthanised أنها إنسانية. ثم سجلت هذه نقطة النهاية إنسانية يوما على المنحنى بقاء كابلان ماير. </li></ol> 5. تقييم الكفاءة العلاجية <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم إنشاء منحنى بقاء كابلان ماير باستخدام GraphPad بريزم 4.03 ل Windows ؛ GraphPad برامج ، سان دييغو ، كاليفورنيا الولايات المتحدة الأمريكية ، <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. وتميزت الوفيات أو euthanizations ونقطة النهاية وسجل الأحداث ك 1. سجلت الحيوانات التي بقيت على قيد الحياة في نهاية التجربة وغير الأحداث وسجل ك 0. </li> 6. ممثل النتائج : بدأت السيطرة على الحيوانات تظهر علامات الاضطراب العصبي وفقدان الوزن 23 يوما بعد التلقيح الأولي من الخلايا. تأخرت كثيرا في هذه المجموعة AMG102 المعالجة لمدة 35 يوما. في الواقع بعد يوم 35 ، 77 ٪ (ن = 7 / 9) كان الموت الرحيم من السيطرة على المجموعة. منحنى البقاء كابلان ماير يدل بوضوح على زيادة كبيرة في البقاء على قيد الحياة في استجابة لAMG102 العلاج (الشكل 3). بعد يوم 70 ، كان 88 ٪ من الفئران التي تم السيطرة الموت الرحيم (ن = 8 / 9) مقارنة ب 37 ٪ (ن = 3 / 8) من AMG102 المجموعة المعالجة. التحليل النسيجي للأدمغة أكد أن جميع الحيوانات 9 في السيطرة على المجموعة الأورام المتقدمة مقارنة ب 3 من 8 AMG102 الفئران المعالجة (الشكل 4). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 : صورة (أ) يظهر داخل القحف المسمار دليل المتمركزة في منطقة تقع مباشرة فوق نواة المذنب. ثم يتم وضع الحقنة مكبلة هاميلتون (محملة مسبقا مع الخلايا) داخل المسمار دليل حتى 2 ملم إبرة يمتد إلى أبعد من توجيه ويتم حقن الخلايا 3.5 ملم داخل نواة المذنب. تتم إزالة في وقت لاحق المحاقن واستبداله مرود (B). يمكن للجهاز ضخ التلقائي (C) لضخ ما يصل الى 10 حيوانات في وقت واحد. يظهر هنا خمس حقن في وقت واحد (D). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2 : رسم تخطيطي للبروتوكول الدراسة. تم حقن الخلايا في يوم 0 مع العلاج التي تبدأ يوم 4. تلقى حقنة مراقبة الحيوانات من برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر) الملكية الفكرية في حين أن مجموعة العلاج تلقى حقنة من AMG102 (100 μg/100 ميكرولتر) IP. اعطيت هذه الحقن كل يوم الثاني على التوالي لمدة 10 يوما. وقدمت ما مجموعه 6 الحقن. ثم تم رصد الحيوانات لمدة 70 يوما بحثا عن علامات على الاضطرابات العصبية والجسدية. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3 : منحنى كابلان ماير بقاء السيطرة وبمقارنة AMG102 الفئران التي عولجت. تم الحصول على البقاء على قيد الحياة كبيرة بعد العلاج مع AMG102 (ع = 0.005). <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4 : Microphotographs أقسام الدماغ الاكليلية يتظاهرون تطوير ورم في الحيوانات السيطرة (A) وعدم نمو المخ السرطانية في الحيوانات المعالجة AMG102 (B). شريط المقياس هو 1 ملم.

<ol><li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li>
<li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMG+102%2C+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+neutralizing+antibody%2C+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li>
<li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+oncogene+addiction%3A+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li>
<li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li>
<li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+%28rilotumumab%29+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li>
<li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li>
<li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+brainstem+tumor+model%3A+functional+and+histopathological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li>
<li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels%2C+activation+status%2C+and+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li>
<li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li>
<li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li>
</ol>

وأيد هذا العمل من خلال منحة بحثية من شركة أمجين

المسمار داخل القحف دليل الأسلوب المعروضة هنا يمكن إنشاء السريع واستنساخه من داخل الجمجمة وxenografts في أيدي أحد الفنيين المدربين الحيوانية ، وبسهولة جدا تنفيذ هذا الإجراء من دون الحاجة لجهاز المجسم. لدينا أسلوب يجمع بين استخدام المسمار دليل ، لتحديد دقيق لمنطقة الدماغ الأكثر ملاءمة لتطوير ورم في الجسم الحي ، ومضخة حقن الآلي التي تسمح للتلقيح في وقت واحد تصل إلى 10 حيوانات في وقت واحد. والتعزيز الداخلي المسمار دليل تستغرق أقل من 5 دقائق لأداء. ضخ الآلي من الخلايا في 30 ميكرولتر / ساعة يستغرق سوى 10 دقيقة لحجم 5 ميكرولتر. هذا يضمن جرعات دقيقة بمعدل ثابت ، ويقلل من خطر الطرد من الخلية إلى منطقة خارج الجمجمة بسبب زيادة الضغط داخل الجمجمة. لقد قمنا أيضا هذا الإجراء مع 10 مجلدات ميكرولتر ولم يلاحظ أي نمو الورم خارج الجمجمة بسبب ارتداد الخلوية. كما مضخة التسريب الآلي كما يسمح بالحصول على تلقيح الحيوانات عدة في وقت واحد يمكننا ضخ ما يصل الى 60 ساعة في الحيوانات مقارنة المجسم الداخلي الذي يقتصر على الحيوانات ما يقرب من 15 ساعة. الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو موقع دليل المسمار في الجمجمة حيث يحدد موقفه النهائي من الموقع الجزء الأكبر الورم. إذا كان الدليل هو المسمار المركزي للغاية ، وسوف يتم حقن الخلايا في المنطقة بين نصفي الدماغ two حين إذا تم وضع دليل للقدما بعيدا ، لن يتم حقن الخلايا في الدماغ على الإطلاق. ولهذا من الضروري أن تكون دقيقة قدر الإمكان في تحديد مكان وجود دليل 2.5 مم و 1 مم الوحشي الأمامي للbregma 1. في هذه الدراسة استخدمت لدينا دليل المسمار الصلب ، وعلى الرغم من مسامير دليل البلاستيك وتتوفر أيضا لتلك التي تتطلب دراسات تصوير الدماغ مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو PET 6. حتى لو كلف مضخة التسريب الآلي باهظة بالنسبة لبعض الجماعات ، لا يزال يتم حقن الخلايا يدويا بسرعة أكبر من النهج المجسم. عموما ، يمكن استخدام هذه السريع ، وطريقة دقيقة وقابلة للتكرار لدراسة دبقي ، نخاعي وأورام جذع الدماغ 7. وقد تم تنفيذ هذا الإجراء على أكثر من 500 فئران المختبرات بين بلدينا مع الوفيات الناجمة عن ردود الفعل غير متوقعة مخدر (&lt;1 ٪). وكانت الفئران التي انسحب مع المسمار دليل وغرست في وقت لاحق مع خلايا لم يموتوا أو تعاني من أي مضاعفات عصبية نتيجة لهذا الإجراء. وقد نجا الحيوانات الماضي 100 يوما من دون أي مضاعفات. وعلى الرغم من أننا يفضل استخدام ماوس أصلع ، ماوس المناعية للخطر مع الشعر مثل SCID تكون مجرد مناسبة شريطة أن إزالة الشعر الجمجمة قبل الجراحة للحفاظ على موقع نظيفة ومنع التداخل مع الشعر المسمار الدليل. هناك العديد من العلاجات الجديدة التي يجري تطويرها حاليا لعلاج دبقي 8-10. وأظهرت مؤخرا أننا يمكن تحت الجلد U87MG xenografts دبقي تثبطها المعاملة مع AMG102 3 ؛ الأجسام المضادة الموجهة إلى أنسنة HGF يخضع حاليا لتقييم سريري في دبقي 5. استخدمنا أسلوب تصف هنا لإنشاء الأورام داخل الجمجمة U87MG في أدمغة الفئران عارية. دراستنا تبين بوضوح مدى فائدة الطريقة ويوضح أن كثيرا من AMG102 يثبط نمو xenografts U87MG مثلي. وسوف نواصل استخدام هذا النموذج لتحديد ما يمكن أن تستخدم العلاجات الأخرى في تركيبة مع AMG102 الحصول على تثبيط أكثر فعالية لنمو الورم.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> Bovogen </td><td> SFBS </td><td></td></tr><tr><td> التربسين </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> سيغما </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> BALB / ج نو / نو الفئران </td><td> ARC بيرث </td><td></td><td></td></tr><tr><td> المسمار هولدر </td><td> البلاستيك واحد </td><td> SD - 1 </td><td></td></tr><tr><td> حفر هولدر </td><td> البلاستيك واحد </td><td> DH - 1 </td><td></td></tr><tr><td> قطعة من قماش الدريل القطني </td><td> البلاستيك واحد </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> المسمار دليل (معدن) </td><td> البلاستيك واحد </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> الدمية المسمار (القلم) </td><td> البلاستيك واحد </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> الحقنة هاميلتون (10 ميكرولتر إبرة عزز 26g) </td><td> نعمة شعبة العلوم ديسكفري </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> مضخة التسريب الدكتوراه 22/2000 </td><td> جهاز هارفارد </td><td> 70-2003 </td><td> اختياري </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> لوحة الحرارية </td><td> جهاز هارفارد </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

برغي دليل بسيط أسلوب للدراسات طعم أجنبي داخل الجمجمة في الفئران

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

لتطعيم الخلايا السرطانية البشرية في دماغ الفئران كبت المناعة وسيلة أنشئت لدراسة سرطان الدماغ بما في ذلك ورم أرومي دبقي (دبقي) ونخاعي. نهج المجسم على نطاق واسع يسمح فقط للحقن حيوان واحد في وقت واحد ، هو العمل المكثف ويتطلب معدات متخصصة للغاية. وقد وضعت المسمار دليل الأسلوب ، وضعت في البداية من قبل لال وآخرون ، من 1 إلى القضاء على المجسم إجراءات مرهقة. نحن الآن في وصف المسمار دليل تعديل النهج الذي هو سريع وآمنة على نحو استثنائي ؛ وكلاهما الاعتبارات الأخلاقية الحرجة. على وجه الخصوص ، تتضمن إجراء لدينا الآن مضخة التسريب الذي يسمح تصل إلى 10 الحيوانات ليتم حقنه في نفس الوقت مع الخلايا السرطانية. للتدليل على فائدة هذا الإجراء ، أنشأنا خلايا دبقي U87MG كما xenografts داخل القحف في الفئران التي عولجت بعد ذلك مع AMG102 ؛ وهو جسم الإنسان كاملا الموجهة إلى HGF / عامل مبعثر يخضع حاليا لتقييم السريرية 2-5. الحقن المنتظم للAMG102 مطولة بشكل كبير في بقاء جميع الفئران مع xenografts U87MG داخل القحف ، وأسفرت عن عدد من العلاجات كاملة. هذه الدراسة تبين أن المسمار دليل الأسلوب هو غير مكلفة ، والنهج استنساخه للغاية لإنشاء xenografts داخل القحف. وعلاوة على ذلك ، فإنه يوفر نموذجا الفسيولوجية ذات الصلة للتحقق من صحة الرواية الاستراتيجيات العلاجية لعلاج سرطان المخ.

من أجل تقييم نماذج علاجية جديدة لعلاج دبقي ، والنماذج ذات الصلة الفيزيولوجية ضرورية. نحن الاستعانة بهيئة المسمار دليل زرع الداخلي لإنشاء نماذج طعم أجنبي داخل القحف أن أكثر سرعة وأكثر أمانا من النهج المجسم.

يُعد تطعيم الخلايا الورمية البشرية في دماغ الفئران المثبطة مناعياً طريقةً معتمدة لدراسة سرطانات الدماغ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي...

الهدف من هذا الإجراء هو إنشاء طعم داخل القحف من سرطان الدماغ لتقييم فعالية عامل علاجي جديد. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت برغي توجيه في الجمجمة، ثم حقن الخلايا في الدماغ من خلال برغي التوجيه. وتتمثل الخطوة التالية في بدء تحدٍ علاجي يستهدف الخلايا الورمية التي استقرت في الدماغ.تتم بعد ذلك مراقبة الحيوانات لرصد الاستجابات العلاجية من خلال تقييم نتائج البقاء على قيد الحياة. وفي النهاية، يمكن للعوامل العلاجية أن تؤثر على نمو الورم والبقاء على قيد الحياة في مجموعات العلاج مقارنة بمجموعات الضبط. يمكن تنفيذ هذا الإجراء قبل عدة أيام من حقن الخلايا.ابدأ بوزن الفئران وتخديرها باستخدام خليط من الكيتامين والزيلازين عبر الحقن داخل الصفاق. وبمجرد أن تتوقف الفئران عن الاستجابة لقرصة إصبع القدم، قم بتجهيز فروة الرأس باستخدام اليود، ثم قم بعمل شق بطول اثنين إلى ثلاثة مليمترات على طول الجانب الأيمن من الخط الناصف وأمام الخط بين الأذنين. يكشف هذا الشق عن الغرز الإكليلية والسهمية للجمجمة.يقع bgma عند ملتقى هذين الغرزتين. حدد نقطة دخول برغي التوجيه على بعد 0.2 0.5 مليمتر جانبياً من bgma ومليمتر واحد أمامياً من bgma. تقع هذه النقطة مباشرة فوق نواة CAU eight.الآن عند العلامة، استخدم مثقاباً يدوياً واصنع ثقباً بعمق 1 mm في برغي الجافية. قم بتثبيت برغي توجيه معقم في الثقب حتى يصبح بمستوى سطح الجمجمة. تأكد من التوقف عن دفع البرغي فور ملامسته لسطح الجمجمة.إذا تسبب البرغي في غرز الجمجمة، فقد تتعرض الجمجمة للكسر. يدعم البرغي الدليلي إبرة قياس 26 بطول 1.6 millimeter. لإغلاق فتحة البرغي الدليلي، أدخل سدادة أو برغياً وهمياً في الدليل.قم بالربط بالبرغي الآن. أغلق الجرح عن طريق تجميع الجلد المقطوع باستخدام الملاقط ولصقه بقطرة من vet bond وتوزيعها على طول حافة الجلد المقطوعة، ثم ثبت الجلد لبضع ثوانٍ حتى يلتصق. وأخيراً، قم بإعطاء مادة عكس التخدير ومسكن الآلام carprofen عن طريق الحقن داخل الصفاق، واترك الفئران لتتعافى على بساط تدفئة.يمكن أن تستغرق عملية الاستعادة ما يصل إلى 20 دقيقة. وفي التجربة النموذجية، تم استزراع خلايا الورم الدبقي U 87 mg في دوارق استزراع أنسجة كبيرة تحتوي على وسط D-M-E-M-F 12 مضاف إليه 5% fetal bovine serum. يوضح هذا القسم كيفية تحضير هذه الخلايا للحقن في يوم إجراء الحقن.قم بحصد الخلايا عن طريق غسل الدورق مرتين أولاً باستخدام PBS دافئ. ثم أضف 10 milliliters من PBS الذي يحتوي على 0.25%trypsin و 0.05%EDTA واحضن الخلايا عند 37 degrees Celsius لمدة خمس دقائق أو حتى تنفصل عن السطح. بعد ذلك، اجمع الخلايا في 10 milliliters من الوسط الغذائي.ضع الخلايا في مقياس كرات الدم (hemocytometer)، وقم بعدّ الخلايا تحت المجهر. يتم طرد مركزي للأنبوب المخروطي سعة 50 milliliter الذي يحتوي على 10 milliliters من الوسط الزراعي والخلايا عند 300 ×g لمدة أربع دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، أعد تعليق الخلايا في الوسط الزراعي بتركيز 10 million cells per milliliter. وعند هذا التركيز، سيحتوي كل 5 µL من معلق الخلايا على 50,000 cells، وهو المقدار المستخدم لكل حقنة داخل القحف.يُحفظ معلق الخلايا المخصص للحقن على الثلج. يُشترط هنا استخدام حجم واحد من الخلايا المعلقة لأن أحجام 5 µL تتبخر بسهولة، مما قد يؤدي إلى تدمير الخلايا. ابدأ بتجهيز حقنة هاميلتون ذات غطاء (cuffed Hamilton syringe).قم بتثبيت حلقة بلاستيكية صغيرة بطرف الإبرة بحيث لا يبرز من الإبرة سوى 2 mm أسفل مخرج برغي التوجيه. يضمن ذلك وصول نقطة التلقيح إلى عمق 3.5 mm. قم بتخدير فأر تم إجراء تعزيز له مسبقاً، ثم قم بعمل شق صغير فوق برغي التوجيه وأزل السدادة المعدنية (stylet).بعد ذلك، املأ المحقنة بخمسة 5 µL من الخلايا المخلوطة جيداً والمخزنة على الثلج. احرص على تجنب وجود فقاعات هوائية في المحقنة لأنها قد تسبب انصماماً أو ارتداداً للخلايا خارج موقع الحقن. ثبت المحقنة في مضخة التروية ثم أدخل الإبرة في الموجه.ابدأ عملية حقن الخلايا بمعدل 30 microliters في الساعة. وباستخدام الجهاز الآلي، يمكن حقن ما يصل إلى 10 حيوانات في المرة الواحدة بمعدل تدفق ثابت. كما يمكن إجراء الحقن يدوياً إذا تم تنفيذه بوتيرة ثابتة ومنتظمة.عند اكتمال عملية التسريب، قم بإزالة المحقنة بعناية، ثم أعد وضع المِسبار (stylet) في برغي التوجيه كما في السابق. أغلق الجرح باستخدام لاصق بيطري (vet bond)، وقدم المسكنات واترك الفئران حتى تتماثل للشفاء. قد تستغرق فترة التعافي ما يصل إلى 20 دقيقة.بعد أربعة أيام من تلقيح خلايا U 87 mg، تم وزن الفئران وتقسيمها عشوائياً إلى مجموعات ضابطة ومجموعات علاجية. حُقنت المجموعة الضابطة بـ 100 microliters من PBS داخل الصفاق، بينما حُقنت المجموعة العلاجية بـ 100 micrograms لكل 100 microliters من MG 1 0 2 داخل الصفاق. كُررت عملية الحقن يوماً بعد يوم على مدار 14 يوماً، بمجموع ست حقنات.بعد الحقنة الأخيرة، تمت مراقبة الفئران يومياً ووزنها كل يومين. تم تحديد نقطة النهاية للحيوان على أنها بداية حدوث خلل وظيفي عصبي ملحوظ مثل فقدان التوازن أو الاضطراب أو الشلل، أو الجفاف، أو فقدان الوزن بنسبة تزيد عن 10% أو الوفاة. وقد سُجلت أيام نقطة النهاية في شكل منحنيات كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة.تم تسجيل الوفيات، أو الحالات التي استدعت إنهاء التجربة، كنقاط نهاية أو أحداث، وأُعطيت درجة واحد. أما الحيوانات التي ظلت على قيد الحياة في نهاية التجربة فقد سُجلت كحالات غير حدثية وأُعطيت درجة صفر كمجموعة ضابطة. بدأت الحيوانات في إظهار علامات اضطراب عصبي وفقدان في الوزن بعد 23 يوماً من التلقيح الأولي بالخلايا.وقد تأخر هذا بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة بـ A MG 1 0 2. وبحلول اليوم 35، تم القتل الرحيم لـ 7 من تسعة حيوانات في مجموعة الضبط. وبحلول اليوم 78، تم القتل الرحيم لتسعة حيوانات من مجموعة الضبط مقارنة بثلاثة فقط من حيوانات مجموعة A MG 1 0 2 المعالجة.أكد التحليل النسيجي للأدمغة أن جميع الحيوانات التسعة في مجموعة الضبط قد أصيبت بالأورام، مقارنةً بثلاثة فقط من الفئران التي عولجت بـ g 1 0 2 في الساعة 8:00 صباحاً.

a-simple-guide-screw-method-for-intracranial-xenograft-studies-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

يمكن تأسيس Luciferase معدلة وورم الدماغ البشري xenografts intracranially athymic في الفئران ، مع رصد لاحقة من نمو الورم والاستجابة للعلاج باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي. بالاشتراك مع بقاء التحليل والرصد تلألؤ بيولوجي هي أداة أساسية للبحوث ما قبل السريرية اختبار العلاجات التي يجري النظر فيها لعلاج أورام المخ.

إنشاء Xenografts استئصال ورم من الدماغ داخل الجمجمة والتحليل اللاحق للنمو الورم والاستجابة للعلاج باستخدام التصوير ضوء بارد

وصفنا طريقة متكاملة لغرس ودقيقة المجسم من خلايا ورم أرومي دبقي الأشكال في أدمغة الفئران عارية والمسلسل...

داخل الجمجمة وزراعة المجسم<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير Bioluminescent من الأعضاء المستمدة من الحيوانات ورم في النظام النموذجي ماوس من الأشكال ورم أرومي دبقي

المصدر: Liou، C. et al. التوصيل داخل المخ البطيني للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء في الفئران التي تتحرك بحرية. J. Vis. Exp. (2022).يوضح هذا الفيديو الحقن داخل الجمجمة للأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) في فأر يتحرك بحرية لدراسة آثارها على السلوك بوساطة الدماغ. يتم إدخال قنية حاقن في قنية توجيه مزروعة في دماغ الفأر. بعد الشفاء ، يتأقلم الفأر في قفص جديد. ثم يتم إدارة SCFAs ، ويتم تسجيل السلوك الحركي.

الحقن داخل الجمجمة للمستقلبات الميكروبية المشتقة من الأمعاء في نموذج الفأر

رواية عالية الدقة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تقنية التصوير لدراسة الاستجابة الديناميكية للمنشآت داخل القحف لنمو الورم والتداوي

تشكل الأورام الدبقية الخبيثة مجموعة غير متجانسة من الأورام الدبقية عالية التسلل ذات السمات السريرية والجزيئية المتميزة. الزينوغرافتات التقويمية الأولية تلخص السمات النسيجية والجزيئية للأنواع الفرعية الخبيثة من الورم الدبقي في نماذج الحيوانات قبل السريرية.

الأولية العظام جليوما Xenografts خلاصة النمو المتسلل و Isocitrate Dehydrogenase الأول طفرة

يمكن استخدام الخلايا النجمية من النوع البري الظاهري والخلايا الجذعية العصبية التي تم حصادها من الفئران المصممة باستخدام أليلات مسرطنة مشروطة ومحولة عن طريق إعادة التركيب الفيروسي بوساطة Cre لنمذجة التسبب في الورم النجمي في المختبر وفي الجسم الحي عن طريق الحقن التقويمي للخلايا المحولة في أدمغة زملاء القمامة المتخصصين في المناعة.

النمذجة الخلايا النجمية إمراض في المختبر و في فيفو استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

الدماغ هو موقع فريد من نوعه مع الصفات التي ليست ممثلة تمثيلا جيدا من قبل في المختبر أو التحليلات خارج الرحم. نماذج الماوس مثلي مع الموقع ونمو الخصائص استنساخه يمكن إنشاء موثوق مع الحقن داخل الجمجمة باستخدام أداة تثبيت التجسيمي وانخفاض ضغط ضخ حقنة.

خلق تشريحيا دقيقة وقابلة للتكرار داخل الجمجمة Xenografts من أورام الدماغ البشري

الخلايا الجذعية هي حاملات علاجية واعدة لعلاج أورام المخ بسبب استدارة الورم الجوهرية. غير الجذعية داخل الخلايا الجذعية تسليم تسليم يتجاوز حاجز الدم في الدماغ ويظهر إمكانات قوية للترجمة السريرية. هذه المقالة تلخص المبادئ الأساسية للتسليم الخلايا الجذعية داخل الأنف في نموذج الماوس من الورم الدبقي.

داخل الأنف تسليم الخلايا الجذعية العلاجية إلى الورم الدبقي في نموذج الفأر

أورام الجهاز العصبي المركزي (CNS) هي السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان لدى الأطفال ، ويتم اختبار العلاجات القائمة على المناعة المحلية بشكل متزايد للمرضى في التجارب السريرية. يصف هذا البروتوكول طرق زرع القنية الموضعية في الفئران للتقييم قبل السريري للدفعات المناعية التي تستهدف أورام الجهاز العصبي المركزي.

زرع قنية داخل الجمجمة لمستقبلات المستضد الخيمري التسلسلي (CAR) في الخلايا التائية في الفئران

يتطلب تطوير نماذج أورام الدماغ لدى الأطفال دقة دقيقة ، باستخدام جهاز تجسيمي لزرع الخلايا السرطانية بدقة. توضح المنهجية المعروضة هنا الخطوات المتبعة في تحضير خلايا ورم المخ ، وإجراء الحقن داخل الجمجمة ، وتنفيذ نظام مراقبة ما بعد الجراحة لتقييم نقش ورم الدماغ.

إنشاء نماذج الطعم الغريب المشتق من تقويم العظام لأورام المخ باستخدام جهاز تجسيمي

هدف هذا البروتوكول هو تزويد الباحثين بتقنية قابلة للتكرار بدرجة عالية للغرسات داخل الجمجمة.

الزرع الفراغي داخل الجمجمة لخطوط الخلايا الغريبة المشتقة من المريض في الفئران

تعلم طريقة البرغي الدليل لإنشاء نماذج زرع داخل الجمجمة لأورام الدماغ في الفئران. تُستخدم هذه التقنية لتقييم فعالية العلاجات الجديدة لأورام الدماغ.

برغي دليل بسيط أسلوب للدراسات طعم أجنبي داخل الجمجمة في الفئران

استكشف المزيد من الفيديوهات