التعبئة والتغليف بفيروس نقص المناعة البشرية أو FIV المستندة إلى محددات التعبير Lentivector وتنبيغ من الجزيئات VSV-G الفيروسية Pseudotyped

الهدف العام من هذا الإجراء هو التعرف على عبوات العدسات الفيروسية. بروتوكول لمدة خمسة أيام. في اليوم الأول ، 2 9 3 ، يتم طلاء الخلايا المنتجة TN بكثافة محسوبة.

في اليوم الثاني ، يتم نقل الخلايا باستخدام ناقل العداس المفضل الذي يحتوي على الجين محل الاهتمام ومزيج البلازميد للتغليف الفيروسي. في اليوم الرابع ، يتم حصاد الحشرة الفيروسية وتركيزها عن طريق إضافة محلول ترسيب فيروس PEG. تتمثل الخطوات النهائية للإجراء في حصاد الفيروس المركز PEG ، ونقل الفيروس ، وإصابة الخلايا بالفيروس المركز من أجل التكاثر الفيروسي.

في النهاية ، يتم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للجينات المتكاملة بثبات لحساب عدد التركيبات المتكاملة المستقرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تعداء البلازما أو نقل الفيروسات القهقرية ، هي أن بروتوكول تغليف فيروس العدسي المحسن لمكتب التحقيقات الفيدرالي ينتج فيروسا نشطا وظيفيا عالي العيار ، مما يتيح التوصيل الفعال إلى أي خلية ثدييات تقريبا ، بما في ذلك الخلايا التي يصعب نقلها مثل الخلايا الجذعية والخلايا الأولية غير المنقسمة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم ليسوا على دراية بتفاصيل البروتوكول الصغيرة ، والتي تعتبر ضرورية لنجاح إنتاج فيروس العيار العالي.

العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا لأن كثافة الخلية التي يتم تصورها من خلال المجهر أثناء التعدي تحدد كفاءة العبوة الفيروسية ، والتي تحدد العيار الفيروسي النهائي. في الحالات التي يحدد فيها تعبير مراسل الفلورسنت القابل للتطبيق كفاءة التعدي ، والذي له تأثير كبير على العيار الفيروسي النهائي. بالإضافة إلى ذلك ، يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا للباحثين للتعرف على أجزاء دقيقة ولكنها مهمة من البروتوكول ، مثل أفضل الممارسات للحفاظ على العقم أثناء العملية برمتها ، وكيفية تجنب تضمين بقايا الخلايا في الفيروس الذي تم حصاده.

تعتمد التعبئة والتغليف الفيروسي الفعال على ثلاثة مكونات. أولا ، يجب أن يحتوي ناقل التعبير الفيروسي على بعض العناصر المطلوبة لتغليف الفيروسات والتكامل المستقر ، بالإضافة إلى عناصر للتعبير عن الجين محل الاهتمام. دبوس شعر قصير أو RNA أو RNA صغير أو شريط مراسل.

ثانيا ، يجب أن توفر بلازميدات التعبئة الفيروسية العدسية البروتينات الأساسية لتعبئة نسخة من الحمض النووي الريبي من التعبير في جزيئات فيروسية زائفة مؤتلفة والنسخ العكسي اللاحق وتكامل الفيروسات عند الإصابة. ثالثا ، يجب أن تكون الخلايا المنتجة ل 2 9 3 TN مقاطعة بشكل عابر مع ناقلات التعبير والتغليف. تنتج هذه الخلايا جزيئات فيروسية زائفة عالية الارتفاع يتم حصادها من وسط الاستزراع.

في النهاية ، يعتمد التنبيغ الناجح للخلايا المستهدفة في الغالب على عدد الجسيمات الفيروسية لكل خلية لنوع معين من الخلية. بمعنى آخر ، يبدأ تعدد العدوى بنمو 2 9 3 خلايا TN. في لوحات زراعة الخلايا 15 سم لمدة 18 إلى 24 ساعة للحصول على طلاقة مشتركة من 60 إلى 80٪.

في وقت التعدي ، ستنتج كل لوحة ما يقرب من 14 مليون خلية لزيادة إنتاجية الفيروس. يمكن استخدام أكثر من لوحة واحدة في اليوم التالي عندما تكون خلايا TN 2 9 3 متقاربة بنسبة 60 إلى 80٪ ، فهي جاهزة للتعداد. لكل صفيحة من الخلايا ، أضف 1.6 مليلتر ، DMEM خال من المصل إلى أنبوب صقر سعة 15 مل.

ثم أضف 22.5 ميكروغراما من PPAC H واحد أو Ppac F1 و 4.5 ميكروغرام من ناقل العدس الخاص بك إلى DMEM واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، أضف 55 ميكرولترا من المودة النقية في نفس الأنبوب والدوامة لمدة 10 ثوان ، متبوعا بحضانة درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، أضف أنبوبا واحدا إلى كل لوحة ثقافة.

بتدوير اللوحة برفق ، ثم احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد 48 ساعة. إذا كان بناء ناقل العدس يعبر عن جين فلوري مثل GFP ، فتحقق من الخلايا تحت المجهر ، فإن التعدي الناجح سينتج عنه 50 إلى أكثر من 90٪ من الخلايا الفلورية الخضراء تجمع الآن المادة الطافية لثقافة الخلية في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. يحتوي المادة الطافية على جزيئات فيروسية زائفة معدية.

لن تؤثر أي خلايا يتم سحبها من اللوحة سلبا على إنتاج الفيروس. لإزالة أجهزة الطرد المركزي للحطام ، فإن المادة الطافية الفيروسية عند 1500 جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم دون إزعاج الحبيبات ، اجمع المادة الطافية الفيروسية مع التأكد من ترك مخزن مؤقت يبلغ حوالي 500 ميكرولتر من المادة الطافية وانتقل إلى الخطوة التالية ، وهي تركيز الجسيمات الفيروسية بعد 72 ساعة من التعداد.

يمكن إجراء مجموعة ثانية اختيارية من السوبر الفيروسي باستخدام نفس التقنية بعد جمع الغطاء الفيروسي. تتركز عن طريق إضافة حجم واحد من محلول ترسيب فيروس الوتد المثلج إلى كل أربعة أحجام من المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي من مادة البولي بروبيلين سعة 50 مل. اقلب المحلول لخلطه.

لا تستخدم دوامة أبدا ، ثم قم بتخزين المحلول دون تقليب عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 96 ساعة. بعد 12 ساعة على الأقل من التبريد ، قم بجهاز الطرد المركزي للخليط عند 1500 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، ستظهر جزيئات الفيروسات العدسية المترسبة من peggo على شكل حبيبات بيج أو بيضاء في الجزء السفلي من الأنبوب.

الآن ، قم بإزالة جميع آثار السوائل عن طريق الشفط الدقيق دون إزعاج جزيئات الفيروسات العدسية المترسبة في الحبيبات. بدلا من ذلك ، قم بإزالة معظم supra natin وأعد تعليق الحبيبات في المتبقي من supinate. ثم انقل التعليق إلى أنبوب معقم بحجم ملليلتر وقم بالطرد المركزي للأنبوب في جهاز طرد دقيق بارد لمدة دقيقتين.

عند 14 ، 000 دورة في الدقيقة ، قم بإزالة المادة الطافية المتبقية وإعادة تعليق حبيبات الجسيمات الفيروسية في الجليد ، البارد ، العازلة المعقمة عند واحد من 10 إلى 100. يقوم الحجم الأصلي بتحويل الحبيبات بعناية إلى محلول دون تكوين أي فقاعات، مما يجعلها باردة في جميع الأوقات. تأكد من تعليق الحبيبات تماما.

أخيرا ، اصنع حبرا من 15 إلى 25 ميكرولتر ، وقوارير مبردة معقمة على الثلج وقم بتخزين القوارير عند سالب 70 درجة مئوية. سينتج عن تشغيل التعبئة الناجح ما بين 10 ملايين إلى 1000 مليون وحدة IFUs لكل مليلتر لنقل الفيروس في صفيحة مزرعة 24 بئرا ، و 50،000 خلية لكل بئر وزراعتها بين عشية وضحاها في ظروف الاستزراع المحددة. يجب أن تكون الخلايا بين 50 إلى 70٪ ملتقية للنقل لأغراض الصعير.

يمكن استخدام خلايا HT 10 80 كخط خلية تحكم سهل التحويل في اليوم التالي لشفط الوسائط من الخلايا. ثم امزج وسط الثقافة مع محلول البط المركز. لذا فإن التركيز النهائي للبط المتحولين هو x واحد ، أضف نصف مليلتر من المحول إلى كل بئر مع الخلايا المستهدفة بالكثافة الصحيحة من 50 إلى 70٪ من الطلاقة Co إضافة فيروس إلى كل بئر عند التخفيفات التالية ، واحد إلى 100 ، واحد إلى 10 ، وتخفيف مستقيم واحد لواحد.

يمكن أن يظل الفيروس على اتصال بالخلايا المستهدفة لمدة تصل إلى 72 ساعة دون تغيير الوسط. بعد 72 ساعة ، سيندمج الفيروس بثبات في جينوم المضيف ويعبر عن الجين محل الاهتمام. إذا كان من الممكن استخدام تعبير علامة الفلورسنت الحالي لتقدير كفاءة التنبيغ مع تخفيفات الفيروس المختلفة ، فيمكن قياس عدد الوحدات المعدية بواسطة QPCR.

بمجرد معرفة عيار الفيروس ، احسب الحجم المناسب للفيروس لتحقيق التعدد المطلوب للعدوى للخلايا المستهدفة الأخرى. يضمن قياس العيار والتحكم في وزارة الداخلية الاتساق بين التجارب والاستعدادات الفيروسية المختلفة. الفيروس جاهز الآن للاستخدام في تجارب إضافية.

كانت كثافة بدء خلايا 2 9 3 TN حاسمة لنجاح التعبئة الفيروسية في يوم التعدين. كانت هذه الخلايا 2 9 3 TN بين 60 و 80٪ ملتقية. بعد 24 ساعة من التعدي الناجح باستخدام ناقل عدسي يعبر عن GFP ، وجد أن ما لا يقل عن 90٪ من 2 9 3 خلايا TN أظهرت مضان أخضر.

72 ساعة من التنبيغ ، استمر GFP في التعبير في الخلايا المضيفة HT 10 80. يشير هذا إلى أن بنية الفيروس العسسي التي تم دمجها بثبات في جينوم المضيف ، مما أدى إلى نقل نفس الخلايا المضيفة عند التخفيف بمقدار عشرة أضعاف ، مما قلل بشكل متناسب من التعبير عن GFP. لأن العلاقة بين العيار الفيروسي والتعبير الجيني بوساطة الفيروسات النسبية تتناسب طرديا.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية على مدار خمسة أيام بحوالي ساعة إلى ساعتين يوميا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تعبئة الجسيمات الفيروسية المعدية وظيفيا بكفاءة وأمان ونجاح في الخلايا المنقولة بالفيروس. لا تنس أن العمل مع فيروس العدسات يمكن أن يكون خطيرا واحتياطات مثل العمل في غطاء ثقافة الأنسجة BSL.

يجب دائما ارتداء معطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.