تصوير إطلاق الناقل العصبي باستخدام المراسلين الفلوريين المعتمدين على الناقل العصبي القائم على الخلية

خذ فأرا بنافذة جمجمة تحتوي على طبقة رقيقة من الجمجمة لتمكين تصور الدماغ.

تقييد حركة الرأس باستخدام قضيب رأس متصل.

يتم حقن القشرة مسبقا بمراسلين هندسيين من الفلورسنت القائم على الخلايا ، أو CNiFERs ، وهي خلايا مراسل تسمح بالكشف في الوقت الفعلي عن إطلاق الناقل العصبي.

تعبر CNiFERS عن مستقبل ناقل عصبي مقترن ببروتين G وكاشف الكالسيوم السيتوبلازمي ، والذي يتكون من مجال ربط الكالسيوم المدمجة مع الفلوروفورات المانحة والمتقبلة.

باستخدام مجهر ثنائي الفوتون ، قم بإثارة الكاشف لإحداث انبعاث مضان للمتبرع ، وتمكين تصور CNiFER.

النشاط العصبي الذي يصل إلى القشرة إلى إطلاق الناقل العصبي.

ترتبط هذه الناقلات العصبية بمستقبلات CNiFER وتنشط مسارات الإشارات التي تحفز إطلاق الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية.

يرتبط الكالسيوم السيتوبلازمي المتزايد بالكاشف ، مما يتسبب في حدوث تغيير توافقي يجلب الفلوروفورات على قرب.

ينقل المتبرع الطاقة إلى المستقبل لتحفيز انبعاث مضان المستقبل ، مما يشير إلى إطلاق الناقل العصبي.

ضع منصة التصوير مع الماوس المقيد بالرأس تحت هدف الغمر في الماء 10x في مجهر تصوير ثنائي الفوتون. أدخل مكعب المرشح لتصوير الحنق الذي يحتوي على مرآة ثنائية اللون عند 505 نانومتر ومرشحات ممر النطاق التي تمتد من 460 نانومتر إلى 500 نانومتر لقياس ECFP و 520 نانومتر إلى 560 نانومتر لقياس السترون.

ثم أضف ACSF إلى البئر ، الذي يحتوي على نافذة الجمجمة الرقيقة ، وقم بخفض هدف الغمر في الماء 10x في ACSF. استخدم العدسة ، جنبا إلى جنب مع مصباح الزئبق ومكعب مرشح GFP لتحديد موقع cNIFERs. الآن ، قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء 40x.

بعد ذلك ، حدد مسار الضوء المناسب للتصوير ثنائي الفوتون. قم بتشغيل الليزر النبضي للفيمتو ثانية القريبة من الأشعة تحت الحمراء. حدد الطول الموجي 820 نانومتر وإعداد الطاقة من 5 إلى 15٪. اضبط جهد PMT1 و PMT2 على قيمة دون الحد الأقصى ، عادة من 500 إلى 1000 فولت ، اعتمادا على PMT.

ثم اضبط الكسب على 1 لكل قناة و 0 الموضع Z للهدف. اخفض الهدف حوالي 100 إلى 200 ميكرومتر من السطح القشري ، وابدأ المسح الضوئي x ، y. اضبط كسب طاقة الليزر وجهد PMT لكل قناة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء لمضان cNIFERs.

بعد ذلك ، استخدم البرنامج لتقييد التصوير بمنطقة تحتوي على خلايا cNIFERs بالإضافة إلى منطقة الخلفية. حدد خط كالمان الذي يبلغ متوسطه لاثنين للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مناسبة ، واستخدم معدل مسح ضوئي من 0.3 إلى 1 هرتز بمعدل 4 ميكروثانية لكل بكسل. بعد ذلك ، ارسم عائد استثمار حول خلايا cNIFER ، وتحيط بحوالي ثلاث إلى أربع خلايا لكل مستوى.

قم بإعداد تحليل في الوقت الفعلي لمتوسط شدة عائد الاستثمار. ثم ابدأ في الاستحواذ لمراقبة مضان cNIFER بمرور الوقت ، وابدأ التحفيز الكهربائي أو تجربة سلوكية أثناء مراقبة الحنق.