دراسة الهيكل الخلوي أكتين في الخلايا البطانية لايف تعرب عن GFP - أكتين

الهدف من هذا الإجراء هو رصد التغيرات الديناميكية في الهيكل الخلوي للأكتين في الخلايا البطانية الحية. أولاً، يتم ترنسفكشن الخلايا البطانية لوريد السرة البشري باستخدام بلازميد A GFP beta actin، وتُزرع حتى تصل إلى مرحلة التلاقي على شرائح غطاء. بعد ذلك، توضع شرائح الغطاء في غرفة تصوير الخلايا الحية المزودة بمنصة تسخين وتسريب لمحلول ملحي فسيولوجي يحتوي على الألبومين.

تتمثل الخطوة النهائية في الحصول على البيانات لمنطقة مختارة من الخلايا عبر التقاط صور بنظام التصوير الزمني (time-lapse) قبل العلاج بعامل دوائي وبعده. ويمكن أن يوفر تحليل الرسوم البيانية باستخدام برامج التصوير مثل Image J رؤى حول بروزات الأقدام الصفائحية (lamely podia) الموضعية، مثل المسافة والزمن وسرعة البروزات، بالإضافة إلى حركة ألياف الأكتين بمرور الوقت. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التصوير المناعي الفلوري في أن تصوير الخلايا الحية يسمح بدمج الطبيعة الديناميكية للأكتين والهيكل الخلوي في دراسات الآليات التي تحدد النفاذية البطانية.

بينما تمثل الخلايا المصبوغة والمثبتة لقطات زمنية فورية وتوفر معلومات محدودة عن ديناميكيات العمل والهيكل الخلوي قبل وبعد المعالجة بوسيط التهابي في خزانة السلامة البيولوجية. يتم تعقيم شرائح التغطية باستخدام 70% ethanol لمدة دقيقتين ثم تُترك لتجف في الهواء. توضع كل شريحة تغطية في طبق زراعة مقاس 10 سنتيمتر، ويُضاف 300 microliters من محلول الجيلاتين الدافئ إلى المركز دون لمس حواف شريحة التغطية، وبعد خمس دقائق، يتم سحب السائل.

قم الآن بحصاد مزرعة متلاحمة من الخلايا البطانية لوريد السرة البشري أو VE باستخدام 0.25%tripsin EDTA. قم بعد الخلايا وتركيزها عن طريق الطرد المركزي. اسحب أكبر قدر ممكن من وسط SUP natum لإجراء تفاعل ترانسفكشن باستخدام طقم VE nuclear effector.

أعد تعليق كرات الخلايا في محلول المؤثر النووي الأساسي وأضف من 0.2 إلى 2 µg من بلازميد ناقل GFP beta actin. انقل 100 µL من معلق الخلايا إلى وعاء qve للمؤثر النووي. انقر على الوعاء المغطى بضع مرات للتأكد من عدم وجود فقاعات بين قاع وعاء Q vet وعينة ترانسفكشن.

ضع الـ Q VET في جهاز nuclear effector two وقم بتشغيل البرنامج A 0 3 4 باستخدام ماصة نقل من مجموعة nuclear effector kit لنقل 500 microliters من وسط EGM two MV الدافئ إلى الـ qve. بعد ذلك، انقل المزيج مرة أخرى إلى أنبوب micro fuge واحضنه لمدة 15 دقيقة. اخلط معلق VE المتحول جينيًا بلطف مرة واحدة، ثم ضع 300 microliters من المعلق على غطاء شريحة مطلى بالجيلاتين دون لمس الحواف.

بعد ذلك، يتم التحضين لمدة تتراوح من ساعة إلى أربع ساعات. افحص الخلايا المنقولة للتأكد من التصاقها بغطاء الشريحة. ثم أضف 10 milliliters من وسط E GM two MV إلى الطبق، واستمر في التحضين حتى يظهر تعبير GFP.

أولاً، أضف وسط محلول ملحي فسيولوجي بالألبومين أو PSS إلى نظام التدفق بالجاذبية وقم بتوصيله بالسخان المدمج. الآن، اضبط منظم التدفق لتحقيق معدل تدفق يبلغ 40 milliliters per hour تقريباً. ثم أوقف التدفق عن طريق إغلاق صنبور الإيقاف باستخدام مسحة قطنية.

ضع شحم التفريغ على الحافة الخارجية للجانب السفلي من حمام الماس. الآن قم بإخراج مزرعة مُعدلة جينياً من الحاضنة. ارفع غطاء الشريحة برفق باستخدام الملقط.

بعد ذلك، وباستخدام منديل Kim wipe، امتص فائض وسط EGM two MV من الشريحة السفلية، مع توجيه وجه الخلايا للأعلى. ضع الحمام الماسي فوق غطاء الشريحة لتشكيل غرفة. ضع الغرفة بسرعة في مسخن المنصة.

أحكم ربط المشابك فوق الغرفة، ثم اسحب ما يقرب من 1 mL من وسط EGM two MV من الطبق إلى الغرفة. الآن، قم بتوصيل خرطوم التفريغ بحامله على الجانب الأيسر من الغرفة، وخط A PSS من السخان المدمج في القناة الموجودة على الجانب الأيمن من الغرفة. بعد ذلك، قم بتشغيل جهاز التفريغ وفتح خط A PSS للسماح بتروية الحمام فوق الخلايا المنقولة.

قم أيضاً بتشغيل السخان المدمج عند درجة حرارة 37 °C. بعد ذلك، ضع مسبار الثرميستور الخاص بالمنصة المسخنة في الحمام عند الحافة، وقم بتشغيل سخان المنصة عند درجة حرارة 37 °C. ولإزالة أي بقايا من وسط EGM two MV وتراكمات الفرز، امسح الجزء السفلي من غطاء الشريحة بعناية باستخدام منديل Kim wipe مبلل بـ 70% ethanol، يليه منديل Kim wipe جاف، ثم اترك خلايا HU المنقولة جينياً لتصل إلى حالة التوازن لمدة 30 دقيقة.

قم بتثبيت المسار. ركز على المنطقة المحددة من الخلايا المستزرعة للدراسة. اضبط وقت تعريض الكاميرا بين 0.5 وثانيتين اعتماداً على شدة إشارة GFP Act في الخلايا.

حدد أيضاً الفواصل الزمنية ومدة التجربة. والآن، مع إطفاء أضواء الغرفة، التقط صورة واحدة لتقييم الإعدادات. ابدأ بالتقاط سلسلة الصور بفاصل زمني (time lapse) مع مراقبة الصور حسب الحاجة.

في البروتوكول النموذجي، يتم الحصول على صور خط الأساس لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة قبل إضافة العامل المختبر، يلي ذلك الحصول على صور إضافية لمدة تتراوح من 0.5 إلى أربع ساعات. وأخيراً، وكما هو مفصل في النص المصاحب، يتم تقييم مسافة بروز الـ lamely podia، واستمراريتها، وسرعتها عن طريق تحليل الرسم البياني CH. وفي التجربة النموذجية، يتم التعبير عن GFP actin في أكثر من 50% من الـ VE المنقولة بطريقة عشوائية.

التقطت هذه الصور، التي تم الحصول عليها بمعدل مرة واحدة في الدقيقة، بروتين GFP actin في جميع أنحاء السيتوبلازم، وكذلك في التراكيب الخيطية وفي الأقدام الكاذبة (melipodia) المحلية التي تبرز على طول حافة الخلية. يتم قياس استمرارية المسافة وسرعة البروزات الخلوية من مجموعات الصور المأخوذة بتقنية التصوير الزمني (time-lapse). وباستخدام تحليل chm graph، يتم أولاً رسم خط من بكسل واحد بشكل عمودي تقريبًا على حافة الخلية.

يتم استخراج هذه المنطقة من كل صورة في مجموعة التصوير الزمني لإنشاء تجميع للمنطقة عبر الزمن أو رسم بياني بتوليد (chime graph)؛ هنا، من منظور من اليسار إلى اليمين في الرسم البياني بتوليد، تُمثَّل النتوءات كحركات صاعدة في حافة الخلية. عندما يتم وضع خط فوق حافة أحد هذه النتوءات، يمكن جمع بيانات البكسل المرتبطة بهذا الخط لقياس ديناميكيات النتوءات كمياً. ويمكن استخدام العدد الإجمالي للنتوءات في الرسم البياني بتوليد لتقدير تردد النتوءات.

يوضح هذا التحليل تحركات ألياف الإجهاد التي تتشكل بالقرب من محيط الخلية وتتحرك نحو مركز الخلية حيث تتفكك في النهاية. في مخطط chio، تظهر ألياف الإجهاد كخطوط مستمرة في المنطقة السيتوبلازمية، وغالباً ما تتحرك للأسفل وإلى اليمين باتجاه مركز الخلية؛ وعندما يصعب رؤية الألياف في مخطط chio الأصلي، يعمل مرشح القناع غير الحاد (unsharp mask filter) على زيادة حدة الصورة، وتسهل الخطوط المرسومة على ألياف الإجهاد عملية جمع بيانات البكسل باستخدام وظيفة القياس (measure function). بدلاً من ذلك، يتم رسم خطوط من بداية ونهاية ليف الإجهاد المحدد، مما يعطي متوسط بيانات البكسل للفترة التي لوحظ فيها الليف.

وضح هذا العرض التقديمي كيفية تحليل البيانات من مجموعة الصور المتقطعة زمنياً عبر تحليل الرسوم البيانية باستخدام برمجيات مثل Image J. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة ديناميكيات الهيكل الخلوي للأكتين استجابةً للوسطاء الالتهابيين باستخدام التصوير الحي للخلايا البطانية المنقولة جينياً.