تصوير ديناميكيات الكالسيوم تحت الخلايا في الخلايا العصبية لالتهاب الغدة المائية

خذ سلالتين منفصلتين معدلة وراثيا Caenorhabditis elegans على شرائح باستخدام وسادات أجار. تحتوي الوسادات على محلول متدحرج بعامل مشلول يقلل من الحركة.

الحبل العصبي البطني للديدان ، أو VNC ، على الخلايا العصبية الداخلية المثيرة التي تعبر عن مؤشرات الكالسيوم السيتوبلازمي في سلالة واحدة ومؤشرات الكالسيوم في الميتوكوندريا في السلالة الأخرى.

ضع غطاء للف الديدان ، وتوجيه VNC للتصور ، ثم ضعها تحت المجهر الفلوري.

استخدم الضوء المرئي لتحديد موقع الديدان، ثم انتقل إلى وضع التألق.

في الخلايا العصبية المريحة ، يحافظ انخفاض الكالسيوم داخل الخلايا على المؤشرات غير مرتبطة ، مما يؤدي إلى ضعف الفلورة.

يفتح النشاط العصبي التلقائي قنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي ، مما يسمح بتدفق الكالسيوم.

في السلالة مع المؤشرات السيتوبلازمية ، يرتبط الكالسيوم بالمؤشرات ، مما يعزز التألق السيتوبلازمي.

يدخل الكالسيوم السيتوبلازمي الزائد إلى الميتوكوندريا من خلال القنوات. في السلالة مع مؤشرات الميتوكوندريا ، يزيد ارتباط الكالسيوم من تألق الميتوكوندريا.

قم بتصوير الخلايا العصبية في كلتا السلالتين لمراقبة ديناميكيات الكالسيوم تحت الخلوية.

في أنبوب ثقافة زجاجي مقاس 13 × 100 ملم ، قم بإعداد 3 ملليلتر من أجار 10٪ عن طريق إذابة أجار الدرجة الجزيئية في M9 والميكروويف لعدة ثوان. لعمل وسادات أجار ، قم أولا بإعداد شريحتين عن طريق إضافة طبقتين من شريط المختبر. ثم ضع شريحة مجهرية بين الشريحتين. قم بقص طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر واستخدمها لسحب قطرة صغيرة من الأجار على منتصف الغطاء.

قم بتسطيح الأجار بالضغط على شريحة أخرى لأسفل أعلى الأجار. بعد التبريد ، قم بتقطيع الأجار إلى قرص صغير باستخدام فتحة أنبوب سعة 10 مليلتر ثم قم بإزالة الأجار المحيط. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول درفلة الدودة عن طريق إذابة مسحوق الموسيمول في M9 لإنشاء مخزون 30 ملليمول. خفف المرق بنسبة واحد إلى واحد بخرز البوليسترين لعمل محلول الدرفلة.

لوضع الدودة للتصوير ، ضع أولا 1.6 ميكرولتر من محلول الدرفلة في وسط وسادة الأجار. بعد ذلك ، باستخدام معول دودة مفضل ، انقل دودة من العمر المطلوب إلى محلول الدرفلة على وسادة الأجار. انتظر لمدة خمس دقائق حتى يقلل الموسيمول من حركة الدودة ، ثم قم بإسقاط غطاء 22 × 22 ملم أعلى وسادة أجار.

لتصوير الخلايا العصبية في الحبل العصبي البطني، قم بلف الدودة عن طريق تحريك الغطاء قليلا. لتركيب الدودة على المجهر ، ضع قطرة من زيت الغمر على الغطاء. أوجد المتنقلة باستخدام هدف تكبير منخفض في المجال الساطع. ثم قم بالتبديل إلى هدف 100X وحدد موقع AVA neurite باستخدام إضاءة GCaMP أو mito-GCaMP باستخدام ليزر التصوير 488 نانومتر.