العزلة وثقافة العصبية الخلايا الجذعية من بصيلات الشعر كريست الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل واستزراع الخلايا الجذعية العصبية الأولية ، أو N CSCs من أنسجة فروة الرأس البشرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق لعن جلد فروة الرأس البشري أولا إلى شرائح بعرض سنتيمتر واحد واحتضانها في وسائط تحتوي على خلجان ديس. ثم يتم ترتيب الجلد في الوسائط الجديدة ويتم سد بصيلات الشعر.

الخطوة الثانية من الإجراء هي علاج بصيلات الشعر بالتربسين ويتم الحصول على معلقات أحادية الخلية. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في فرز CD 2 71 HNK ، وواحد موجبة مزدوجة ncsc باستخدام قياس التدفق الخلوي والصفيحة في لوحات الاستزراع. في نهاية المطاف ، يتم استخدام الفحص المجهري للتباين الطوري لدراسة تكوين المجال العصبي ونموه ، حيث يعد عرض هذه الطرق أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم الخطوات الرأسية لاستخراج وعزل الصحة لأنه من الصعب جدا تشريح الجلد والجزيئات الصحية تحت المجهر.

للتحضير لزراعة الخلايا الجذعية ، قم بتغطية قاع كل بئر من ستة ألواح بوائر مع بولي دي ليسين ، اترك الألواح تجف في الغطاء. بمجرد أن تجف الآبار ، اشطفها بالماء المعقم والشفط ، ثم اترك الآبار تجف مرة أخرى. قم بتغطية الألواح بمحلول 0.17 ملليغرام لكل مليلتر من الفيبرونكتين.

ثم قبل أن يجف الفيبرونيكتين في اللوحة في وسط ثقافة NCSC ، قم بإعداد وتجهيز الوسائط والكواشف التالية. 97٪ D-M-E-M-F 12 2٪ B 27 مكمل 1٪ واثنين من الملحق B-F-G-F-F-E-G-F IGF واحد وdiss. اجمع جلد فروة الرأس البشري البالغ الطازج من إجراءات شد الوجه أو أنسجة فروة رأس الجنين واغسلها باستخدام PBS الذي يحتوي على البنسلين ستربتومايسين.

نقل الجلد إلى أنابيب 50 مليلتر وتحضنها في DMEM مع 10 ملليغرام لكل مليلتر مساحة DIS عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل الجلد إلى طبق بتري معقم وقم بإزالة الشعر من الجلد عن طريق الإمساك بجذع الشعرة بالقرب من سطح الجلد وسحبه بقوة وسلاسة. ستظهر بصيلات الشعر إما مورفولوجيا أورجين المستضد ، وتحتضن شظايا البصيلات المعزولة في 0.05٪ رحلات في EDTA لمدة 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز العرضي.

ثم أضف أربعة ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS لإيقاف التفاعل. بعد ذلك ، قم بتمرير الظهارة المسامية عبر مرشح 40 ميكرون للحصول على معلق خلية واحدة يحتوي على خلايا مختلفة الحجم والشكل. ثم قم بتدوير التعليق عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق.

تخلص بعناية من المادة الطافية S وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS مع 2٪ FBS لعزل N CSCs باستخدام الحقائق أولا ، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة ضد قرص مضغوط مترافق بالكمبيوتر 2 71 FE C مترافق hnk واحد أو CD 2 71 PE مترافق ألفا أربعة إنتجرين عن طريق الحضانة على الجليد لمدة 40 دقيقة في جهاز الطرد المركزي المظلم عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وشفط المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في PBS التي تحتوي على 2٪ FBS وميكروغرامين لكل ملليلتر. يوديد البروبيديوم لإخراج الخلايا الميتة.

قم بإجراء فرز الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي وجمع CD 2 71 H و K واحد موجب مزدوج أو CD 2 71 alpha four إنتجرين ثقافة الخلايا الإيجابية المزدوجة. الخلايا في لوحات التعلق المنخفضة للغاية في وسط NCSC ، وتغيير الوسط مرة واحدة يوميا. افحص زراعة الخلايا كل يوم تحت المجهر.

سيبدأ NCSC في تكوين مجاميع صغيرة عائمة بعد عدة أيام وكرات جيدة التكوين في غضون أسبوعين إلى خمسة أسابيع في المزرعة ، اعتمادا على عمر المتبرعين. سيظهر النمو في غضون أيام قليلة في منطقة الانتفاخ والكرات جيدة التكوين في الموقع في غضون عدة أسابيع عندما يتم زراعة بصيلات الشعر بأكملها في وسط NCSC. لتوسيع ثقافات NCSC ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS المسبق مرتين في EDTA إلى 37 درجة مئوية.

ثم أضفه إلى الخلايا لمدة سبع إلى 15 دقيقة حتى تنفصل الخلية الجذعية لبصيلات البرد. لإيقاف الرحلات ، قم بإضافة DMEM مع 10٪ FBS ، قم بسحب الأنابيب برفق لأعلى ولأسفل لتفريق الخلايا. ثم قم بالدوران عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق الخلايا في وسط NCSC والصفائح المطلية ب Fibronectin عند 37 درجة مئوية. ثقافة NCSC. الوسط كاف للحفاظ على NCSC البشري في حالة غير متمايزة.

بدون الحاجة إلى الخلايا المغذية ، لن تتكاثر الخلايا الكيراتينية وتموت تدريجيا في الوسط. سوف تتكاثر بعض الخلايا المستديرة الصغيرة وتشكل مجاميع صغيرة معلقة. بعد ثلاثة إلى خمسة أيام ، يزداد حجم هذه الركام العائم ببطء مما يؤدي إلى توليد الكرة ثلاثية الأبعاد مثل الهياكل ، والتي تسمى كرات الشعر.

عند زراعة الألواح المشفرة ، تلتصق N CSCs بالسطح وتنمو بشكل أسرع من الخلايا المكونة للكرة في التعليق ، حيث تشكل الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية المرفقة. علامات NCSC عبر عندما تكون بصيلات الشعر بأكملها مستزرعة ، تتشكل الكرات في المنطقة المقابلة لمنطقة الانتفاخ. بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية العزلة والثقافة.

الخلايا الجذعية العصبية الأولية من أنسجة فروة الرأس الهيرما.