كشف وGenogrouping من Noroviruses من براز الأطفال وذلك في خطوة واحدة Taqman RT-PCR

الكشف عن الفيروس العصبي في الحمض النووي الريبي المستخرج بخطوة واحدة في الوقت الفعلي R-T-P-C-R باستخدام مجسات TECHMAN محددة. لكننا سنتحدث اليوم عن الفيروسات العصبية. هذا في ليما ، بيرو وهي مجموعة من الجامعة وأيضا جامعة جونز هوبكنز.

اتضح أن نوروفيروس هو على الأرجح أحد أسباب الإسهال الأكثر إهمالا. وجدت مجموعتنا أن نوروفيروس هو ثاني فيروس كورونا من حيث دخول الأطفال إلى المستشفى بسبب الإسهال وأيضا من حيث عدد حالات الإسهال على أساس السكان. فلماذا لم يتم تشخيص الفيروس العصبي من قبل؟

حسنا ، والسبب هو أنه فيروس RNA ولا يمكننا الزراعة ، لذلك يتطلب الأمر طرقا بيولوجية جزيئية خاصة للتشخيص. هذه الطرق التي نستخدمها هي R-T-P-C-R ، وهذا سيوضح كيفية استخدام وتشخيص كيفية استخدام R-T-P-C-R لتشخيص الفيروسات العصبية. طريقة Ciag GUINE الداخلية boom etal 1989 استخدمنا طريقة G guine ATE داخلية لاستخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي لعينات البراز.

هذه الطريقة هي بديل لمجموعة الحمض النووي الريبي الفيروسي التجاري caamp. تعتمد كلتا الطريقتين على خصائص ربط الحمض النووي لجزيئات السيليكا. جنبا إلى جنب مع الخصائص المضادة للنوكلياز ل G Guad Dium Bio NA لإعداد تعليق السيليكا لاستخراج الحمض النووي الريبي.

لتحضير جزيئات السيليكا ، خذ 30 جراما من ثاني أكسيد السيليكون ، وأضف 250 ملم من الماء منزوع المعادن السيليكون عن طريق الرج. بعد 24 ساعة من الترسيب ، قم بإزالة 215 مل من supinate والجزء عن طريق الشفط عند 250 مل من الماء منزوع المعادن ومرة أخرى ، قم بتعليق السيليكون عن طريق الرج. بعد 24 ساعة أخرى ، قم بإزالة supinate عن طريق الشفط واضبط درجة الحموضة لتعليق السيليكا على درجة الحموضة 2.0 باستخدام تعليق حمض الهيدروكلوريك qu من السيليكا في زجاجات واستخراج الأوتوكلاف مع g guin والسيليكا.

سنلقي نظرة الآن على استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام جزيئات السيليكا المعدة في خطوة سابقة. يحفظ على حرارة 70 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. لعمل تعليق براز بنسبة 10٪ ، خذ ما يقرب من 0.1 جرام من البراز واستكمل مع ملليلتر واحد من PBS قبل الاستخراج.

عينات الحمل دوامة لمدة خمس ثوان ثم أجهزة الطرد المركزي عند 4 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. في كل تفاعل ، عينة براز إيجابية للفيروس العصبي كتحكم إيجابي والمياه المعالجة DEPC في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. امزج ما يلي ، مليلتر واحد من L ستة عازلة ، و 20 ميكرولتر من جزيئات السيليكا المحضرة و 200 ميكرولتر من مستخلص البراز.

دوامة لفترة وجيزة واترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية. ثم اغسل الحبيبات مرتين باستخدام المخزن المؤقت L اثنين ، ثم غسلتين ب 70٪ من الإيثانول وغسل واحد بالحمض.

جفف الحبيبات في كتلة تسخين جافة عند 56 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بترطيب الحمض النووي الريبي في حبيبات السيليكا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من الحمض النووي الريبي. أضف ميكرولتر واحد من دوامة الحمض النووي الريبي ويترك عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

حريش لمدة ثلاث دقائق بأقصى سرعة واجمع درجة حرارة مستقرة تحتوي على الحمض النووي الريبي. حدد العينات بتقنية عدم السقوط وقم بتخزين الحمض النووي الريبي المستخرج عند 70 درجة مئوية تحت الصفر. حتى استخدام الاستخراج التجاري للحمض النووي الريبي الفيروسي.

سنقوم الآن بعرض استخراج الحمض النووي الريبي من البراز باستخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي المتاح تجاريا. تحتوي المجموعة على المخزن المؤقت لعمود MinPin هلام السيليكا التالي ، و A-V-L-A-W واحد و W2 A VE والحمض النووي الريبي الناقل الورقي. ايجاز. الإجراء على النحو التالي.

امزج جزءا من المخزن المؤقت A VL مع الحمض النووي الريبي الحامل وأنبوب الدوامة في المحلول في أنابيب سعة 1.5 مليلتر عند 114 ميكرولتر من تعليق البراز وخلطها عن طريق الرسائل النصية بعد الحرب. احتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. نبض الطرد المركزي العينات.

أضف الإيثانول إلى العينات واخلطه عن طريق الرسائل النصية بعد الحرب لمدة 15 ثانية. ثم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة ، قم بتطبيق المحلول على عمود الدوران في أنبوبين من أنبوبي التجميع البسيطين. سحب fuge.

ثم ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد. اغسل العمود بالحمض النووي الريبي المرتبط باستخدام المخزن المؤقت A W واحد بدون جهاز طرد مركزي RAN ناقل. ضع العمود في أنبوب تجميع نظيف سعة ملليلتر وراقب العمود مع المخزن المؤقت.

جهاز طرد مركزي W2 بأقصى سرعة يضع عمود دبوس في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 ملليلتر وطرد مركزي بأقصى سرعة. ورفع الحمض النووي الريبي باستخدام مخزن مؤقت للحمض النووي الريبي الفيروسي عند 70 درجة مئوية تحت الصفر حتى يستخدم اكتشاف الفيروس العصبي في الحمض النووي الريبي المستخرج بخطوة واحدة في الوقت الفعلي PCR مع مجسات تقنية محددة لعمل مزيج من الفأر لمجموعة الجينوم الأولى ومجموعة دينا الثانية ، واحتفظ بمزيج الإنزيم RT الخاص بك على الجليد أثناء الفحص. يحتوي الإعداد على المجموعة على إتقان المياه التالي لمتلازمة تكيس المبايض ، وبيضتين ، وبادئات ومجسات لدينا.

المجموعة الأولى بادئات ومسبار لمجموعة دينا الثانية. وأخيرا ، فإن كاشف دوامة H لخلط الإنزيم RT قبل استخدام QU لماء PCR ، والمزيج الرئيسي اثنين من البادئات X فحم الكوك G ، وواحد أمامي وعكسي ، وحلقة مسبار واحدة A وواحدة B ل UniGroup. مزيج عضلي واحد ويقوم بإعداد COG G اثنين لآية VA والمسبار.

الحلقة الثانية لمجموعة ثيو اثنين من مزيج رئيسي. وأخيرا ، أضف إنزيم artix إلى كل من مزيج عضلات مجموعة INO. دوامة وألكو 10 ميكرولتر من مزيج العضلات المناسبة لآبار التفاعل.

في خزانة أخرى ، أضف خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي غير المخفف ، وخمسة ميكرولترات ، و G واحد و G اثنين من الحمض النووي الريبي للتحكم الإيجابي وخمسة ميكرولتر من التحكم السلبي إلى عجلات التفاعل المقابلة. أجهزة الطرد المركزي تستنفد لمدة 10 ثوان عند 6 ، 000 جم. في الخطوة الأولى ، يظهر البرنامج الإعداد المتقدم.

وفي شاشة خاصية التجربة ، يتم تحديد التجربة على أنها نوروفيروس. نوع التجربة هو الوجود أو الغياب على الشاشة المستهدفة. أدخل اسم الهدف الذي تريد اكتشافه في لوحة تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

جينا ، المجموعة الأولى والثانية من المراسلين العائلة ومروي تمارا على العينة وتكرار الشاشة. أدخل عدد العينات وعناصر التحكم الإيجابية والسلبية المضمنة في لوحة التفاعل ثم حدد العينات أو الاتجاه المستهدف لإعداد طريقة التشغيل في التشغيل. أولا ، قم بإجراء نسخ عكسي عند 50 درجة مئوية لتخليق الحمض النووي التكميلي.

ثم ارفع درجة الحرارة إلى تسع إلى خمس درجات مئوية لتنشيط بوليميراز البداية الساخنة. ابدأ ركوب الدراجات حسب المدة من تسع إلى خمس درجات مئوية ، متبوعة بخطوة ركوع وتضخيم مشتركة عند 60 درجة مئوية. كرر ركوب الدراجات أربع إلى خمس مرات للعودة إلى إعداد اللوحة.

انقر فوق حفظ قالب واحفظ التجربة. انقر فوق بدء التشغيل. تتيح لك شاشة مؤامرة التضخيم عرض تضخيم العينة حيث تقوم أداتك بجمع البيانات المجمدة أثناء التشغيل بالإضافة إلى تباين المؤامرة.

تألق الغوص الطبيعي ورقم الدورة. في الدورات الأولية لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، هناك تغيير طفيف في إشارة الفلورسنت. هذا يحدد خط الأساس.

الزيادة في التألق حول خط الأساس إلى الكشف عن الهدف المتراكم. يجب تعيين عتبة فلورية ثابتة حول خط الأساس. يتم تعريف دورة عتبة CT للمعلمة على أنها رقم الدورة الكسرية التي يتجاوز عندها التألق العتبة الثابتة.

شاشة مخطط التضخيم مفيدة لتحديد وفحص التضخيم غير الطبيعي مثل زيادة التألق في آبار التحكم السلبية وغياب التألق القابل للاكتشاف في دورة متوقعة. طريقة المجموعة موثوقة ، لكنها تتطلب قدرا هائلا من الوقت والموارد. لقد أظهرنا هنا طريقة موثوقة بنفس القدر وفعالة من حيث التكلفة وتستخدم بسهولة في الكواشف القطرية ، متجاوزة الاعتماد على المواد المشتراة في الخارج ، وكل ذلك سيؤدي في النهاية إلى تشخيص يسهل الوصول إليه وعلاج سريع للأسباب الفيروسية الأكثر شيوعا لالتهاب المعدة والأمعاء عند الأطفال باستخدام الطريقة الاقتصادية الداخلية لعزل الأحماض النووية ، التي حصلت على نتائج مماثلة لهؤلاء.

تم الحصول عليها باستخدام المجموعة التجارية من Kerogen ، جنبا إلى جنب مع TAC MAN ، R-T-P-C-R ، التي تم تطويرها في مختبرنا. يمكننا اكتشاف مجموعة واسعة من عدوى الفيروسات العصبية. أثبت الاختبار أنه مفيد للتشخيص الروتيني لأنه يلغي معالجة المنتج بعد التضخيم ، وبالتالي تقصير وقت الفحص.

إلى جانب التشخيص ، يمكن أيضا استخدام البروتوكول لتوضيح وبائيات عدوى الفيروسات العصبية ، وبالتالي فهو مفيد في مكافحة الصحة العامة لهذا المرض.