تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار تحضير العينات البيولوجية للتقسيم والتصوير تحت مجهر مسح حافة السكين ، أو KESM وتصور بيانات مكدس الصور الناتجة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تثبيت الأنسجة وتلطيخها وتضمينها أولا لإعدادها للتصوير تحت KESM. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تكوين KESM وإجراء التقسيم والتصوير باستخدام برنامج التحكم الآلي.

ثم يتم تسجيل الصور الناتجة وتقليل الضوضاء واقتصاصها. الخطوة الأخيرة هي تحميل واستكشاف مجموعات البيانات في أطلس قائم على الويب وبرنامج تصور ثلاثي الأبعاد. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر مستوى الدماغ بالكامل ، وتنظيم الخلايا العصبية والأوعية الدموية بدقة ميكرومتر فرعي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على Mesos الموجودة ، مثل المجهر الكهربائي لمسح قاعدة الكتلة التسلسلية ، هي أنها يمكن أن تصور أحجام أكبر بكثير ، وإن كان بدقة أقل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الخلايا العصبية وعلم الأعصاب بشكل عام. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للتنظيم الهيكلي للدماغ ، ويمكن أيضا تطبيقها على أجهزة الأعضاء الأخرى مثل الرئة والكلى.

لبدء هذا الإجراء ، يتم وضع دماغ الفأر المقطوع في وعاء زجاجي يحتوي على محلول جولجي كوكس. ضع البرطمان الزجاجي في صندوق محكم خفيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 16 أسبوعا. خطوة التثبيت المنفصلة ليست ضرورية لأن محلول Golgi Cox يعمل كمثبت.

بعد 10 إلى 16 أسبوعا ، اشطف الدماغ بالماء منزوع الأيونات طوال الليل في الظلام في اليوم التالي ، واغمر الدماغ المغسول في محلول هيدروكسيد الأمونيوم بنسبة 5٪ في الماء منزوع الأيونات لمدة سبعة إلى 10 أيام في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد سبعة إلى 10 أيام ، اشطف الدماغ مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات. ثم قم بتجفيف الدماغ من خلال سلسلة متدرجة من الكحوليات الإيثيلية ، وتركه في كل محلول لمدة 24 ساعة ، 50٪ إيثانول و 70٪ إيثانول عند أربع درجات مئوية و 85٪ إيثانول.

ثلاثة تغييرات بنسبة 95٪ من الإيثانول وأربعة إلى خمسة تغييرات بنسبة 100٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع الدماغ المجفف في الأسيتون وقم بإجراء ثلاثة إلى أربعة تغييرات لكل منها ليوم واحد. بعد ذلك ، ضع الدماغ طوال الليل في الثلاجة في كل من مخاليط الأسيتون هذه مع نسبة aite إلى acetone من واحد إلى اثنين ، واحد إلى واحد ، واثنين إلى واحد.

أخيرا ، ضع الدماغ في الثلاجة بنسبة 100٪ ، وقم بإجراء ثلاثة تغييرات في كل مرة بين عشية وضحاها. ثم يتم دمج الدماغ المعالج في 100٪ aite وتسخينه إلى 60 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. أخيرا ، يتم تثبيت كتلة العينة المعالجة على حلقة العينة المعدنية ، واستخدامها إيبوكسي وجوانب الكتلة مشذبة حسب الضرورة لبدء هذا الإجراء.

تأكد من أن الفأر مخدر بعمق ولا يستجيب لقرص إصبع القدم. ثم يتم حشو الفأر بحرارة باستخدام محلول ملحي مخزن بدرجة حرارة الغرفة ، متبوعا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد بنسبة 4٪ من الفورمالديهايد. بعد ذلك ، قم ببث الماوس بمحلول 0.1٪ thi وصبغ في الماء منزوع الأيونات.

بعد ذلك ، ضع الجسم في ثلاجة أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، أخرج الدماغ من العجل وضعه في محلول جديد بنسبة 0.1٪ ثيونين. اترك الدماغ عند أربع درجات مئوية لمدة سبعة أيام.

بعد سبعة أيام ، احتجز الدماغ وتجفيفه من خلال سلسلة متدرجة من الكحول الإيثيلي. على مدى فترة زمنية مدتها ستة أسابيع ، من ثلاثة إلى خمسة أيام في 50٪ من الإيثانول ، ومن سبعة إلى 10 أيام في 70٪ من الإيثانول حوالي أسبوعين لكل من 85 و 95٪ من الإيثانول ، والباقي من الوقت في 100٪ من الإيثانول. بعد ثلاثة تغييرات في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة ، يتم تضمين الدماغ في بلاستيك مثقف في فرن 60 درجة مئوية.

لبدء إجراء تلطيخ شبكة الأوعية الدموية بحبر الهند ، تأكد من خلال عدم وجود منعكس انسحاب إصبع القدم أن الماوس مخدر بعمق. ثم قم بنقع الفأر بحرارة ودية باستخدام محلول ملحي مخزن بدرجة حرارة الغرفة ، متبوعا بدرجة حرارة الغرفة ، فورمين مخزن محايد بنسبة 10٪. نضح الجسم بالكامل بالمحلول الملحي والمثبت ضروري لتطهير الدم من نظام القلب والأوعية الدموية وإصلاح الأنسجة.

بعد ذلك ، قم بعمل الماوس ب 3.0 سم مكعب من نضح حبر الهند غير المخفف. مع الهند الحبر ضروري لملء الأوعية الدموية من نظام القلب والأوعية الدموية. بعد إزالته من الفأر ، يتم تجفيف الدماغ الناتج من خلال سلسلة من الكحوليات الإيثيلية المتدرجة ثم يتم تضمينه في البلاستيك المثقف.

باتباع البروتوكول الموضح سابقا لإعداد KESM للتصوير ، قم بتشغيل الكاميرا والإضاءة والمسرح ، ورفع السكين والهدف. بعد ذلك ، قم بتثبيت حلقة العينة. ثم اخفض الهدف والسكين.

قياس أبعاد العينة. ثم قم بإنشاء ملف تكوين لوحدة التحكم في مرحلة KESM. تطبيقان ، رفع السكين والهدف من KESM قبل تهيئة المرحلة.

ابدأ تشغيل وحدة التحكم في مرحلة KESM الثانية وتهيئة المرحلة. ثم اخفض السكين والهدف وقم بتشغيل المضخة. قم بتركيز الهدف والكاميرا عن طريق تدوير مقبض التركيز البؤري على القطار البصري وضبط مجال رؤية الكاميرا بالنسبة لحافة السكين.

انقر خطوة بخطوة للتحقق من الخطوات القليلة الأولى للتصوير والتقسيم. ثم انقر فوق انتقال. لبدء التصوير والتقسيم لمعالجة الصور.

قم بتشغيل معالج مكدس KESM لإزالة الأداة الظاهرية للإضاءة وتطبيع كثافة الخلفية في جميع الصور. كرر ذلك لجميع المجلدات الفرعية للبيانات. لتصور البيانات باستخدام أطلس الدماغ KESM ، انتقل إلى هذا الموقع وحدد الأطلس المناسب للذهاب إلى عمق مختلف.

حدد من القائمة المنسدلة ، مدى العمق الذي يجب أن تذهب إليه في كل خطوة ، ثم انقر فوق إما زائد لزيادة أو ناقص لتقليل عمق Z. تشمل الخيارات الأخرى التكبير أو التنقل باستخدام أطلس الدماغ KESM. استخدم القائمة المنسدلة لضبط رقم التراكب والفاصل الزمني للتراكب لتصور البيانات باستخدام مختبر VIS.

قم بتشغيل التطبيق ، وقم بإنشاء مشروع جديد. يجب أن يتضمن المشروع إنشاء 3D من ملفات 2D تعيين مصفوفة العالم الحساب واحد وعرض 3D متصلة. بهذا الترتيب ، يجب تعيين المعلمات المناسبة كما هو موضح في العرض 3D أثناء الضغط على زر الماوس الأيمن.

حرك الماوس لضبط مناطق العتبة يمكن اقتصاصها. تغير الاتجاه أو تغير الإضاءة أو تشغيل الخلفية أو إيقاف تشغيلها. يتم توضيح نتائج KESM التمثيلية من خلال مقاطع الفيديو التالية المعروضة أولا هي تصورات الحجم ل KESM ، مكدسات بيانات حبر Brain India الكاملة لمجموعة بيانات الأوعية الدموية ، بدءا من لقطة مقربة لبيانات الأوعية الدموية بعرض حوالي 100 ميكرون.

يظهر هذا المقطع الثاني من KESM ، بيانات حبر Brain India الكاملة ثلاث طرق عرض قياسية لالأوعية الدموية لدماغ الفأر بالكامل ، وهي عينات من بيانات عالية الدقة بعرض حوالي 10 ملليمترات. المنظر السهمي ، والمنظر الإكليلي ، والمنظر الأفقي ، بالإضافة إلى ذبابة من خلال القسم الإكليلي. KESM. يتم توضيح بيانات فأر الدماغ الكامل Golgi في مقطع الفيديو هذا الذي يظهر ذبابة على طول مستويات التقسيم الثلاثة المختلفة ، بدءا من عرض الكتلة ، متبوعا بالعرض السهمي ، والعرض الإكليلي ، والمنظر الأفقي.

عرض التفاصيل التالية لبيانات GoGy لماوس الدماغ الكامل KESM. هذا الفيديو كليب الأول هو لخلايا المخيخ وبركنجي. يظهر هذا المقطع الثاني القشرة والخلايا شبه المعدنية.

أخيرا ، KESM. يتم توضيح بيانات الدماغ بالكامل في مقطعي الفيديو هذين. يظهر أولا لقطة مقربة لبيانات NLE.

يعرض هذا المقطع الثاني ثلاث طرق عرض قياسية لغواصات بيانات Nle لدماغ الفأر بالكامل التي تم أخذ عينات منها من بيانات عالية الدقة. يظهر أيضا مقطع عرضي للحصول على رؤية واضحة للهياكل الداخلية بعد هذا التطور. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الشبكات العصبية والأوعية الدموية في دماغ الفأر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لإعداد العينة والتصوير وتحليل البيانات لمجهر مسح حافة السكين.