تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تحضير العينات البيولوجية لعمليتي التقطيع والتصوير باستخدام المجهر الماسح ذو حافة السكين، أو KESM، وتصور بيانات مجموعة الصور الناتجة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت النسيج وصبغه وطمره لتحضيره للتصوير تحت مجهر KESM. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تهيئة مجهر KESM وإجراء عمليتي التقطيع والتصوير باستخدام برنامج التحكم الآلي.

تخضع الصور الناتجة بعد ذلك لعمليات إزالة الضوضاء، والتسجيل، والقص. وتتمثل الخطوة النهائية في تحميل مجموعات البيانات واستكشافها باستخدام أطلس قائم على الويب وبرنامج للتصور ثلاثي الأبعاد. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر التنظيم العصبي والوعائي على مستوى الدماغ بالكامل وبدقة أقل من الميكرومتر.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بطرق التصوير متوسطة المقياس (Mesos) الحالية، مثل التصوير المجهري الإلكتروني الماسح للمقاطع التسلسلية، في قدرتها على تصوير أحجام أكبر بكثير، وإن كان ذلك بدقة أقل. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم الاتصالات العصبية (connectomics) وعلم الأعصاب بشكل عام. كما يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤية معمقة حول التنظيم البنيوي للدماغ، ويمكن تطبيقها أيضاً على أجهزة عضوية أخرى مثل الرئة والكلية.

لبدء هذا الإجراء، يوضع دماغ الفأر الذي تم تشريحه في وعاء زجاجي يحتوي على محلول جولجي كوكس (Golgi Cox Solution). يوضع الوعاء الزجاجي في صندوق معتم عن الضوء في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 10 إلى 16 أسبوعاً. لا تبرز الحاجة إلى خطوة تثبيت منفصلة لأن محلول جولجي كوكس يعمل كمثبت.

بعد مرور 10 إلى 16 أسبوعاً، يُشطف الدماغ بالماء منزوع الأيونات طوال الليل في الظلام، وفي اليوم التالي، يُغمر الدماغ المشطوف في محلول هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز 5% في ماء منزوع الأيونات لمدة تتراوح من سبعة إلى 10 أيام في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور سبعة إلى 10 أيام، يُشطف الدماغ مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات. بعد ذلك، يتم تجفيف الدماغ عبر سلسلة متدرجة من الكحول الإيثيلي، مع تركه في كل محلول لمدة 24 ساعة، وهي 50%ethanol و 70%ethanol عند درجة حرارة أربع درجات Celsius و 85%ethanol.

ثلاث عمليات تغيير بـ 95% ethanol وأربع إلى خمس عمليات تغيير بـ 100% ethanol في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يوضع الدماغ منزوع الماء في acetone وتُجرى من ثلاث إلى أربع عمليات تغيير، بمعدل عملية واحدة يومياً. بعد ذلك، يوضع الدماغ طوال الليل في الثلاجة في كل من خلائط aite acetone هذه بنسب aite إلى acetone تبلغ 1:2، و1:1، و2:1.

وأخيراً، يُوضع الدماغ في 100%aite في الثلاجة، مع إجراء ثلاثة تغييرات للمحلول، بحيث يتم كل تغيير على مدار ليلة كاملة. بعد ذلك، يُطمر الدماغ المعالج في 100%aite ويُسخن عند 60 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. وفي النهاية، تُثبت كتلة العينة المُعالجة على حلقة عينات معدنية باستخدام الإيبوكسي، وتُقلم جوانب الكتلة حسب الضرورة لبدء هذا الإجراء.

تأكد من أن الفأر في حالة تخدير عميق وغير مستجيب لقرصة إصبع القدم. بعد ذلك، قم بإجراء التروية القلبية للفأر باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات في درجة حرارة الغرفة، يليه محلول بارافورمالدهيد منظم بالفوسفات بتركيز 4% وبارد. بعد ذلك، قم بتروية الفأر بمحلول من thi and dye بتركيز 0.1% في ماء منزوع الأيونات.

بعد ذلك، ضع الجسم في ثلاجة بدرجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة. وبعد مرور 24 ساعة، أخرج الدماغ من القالب وضعه في محلول جديد من Thionine بتركيز 0.1%. اترك الدماغ في درجة حرارة 4 °C لمدة سبعة أيام.

بعد مرور سبعة أيام، يتم تثبيت الدماغ وإزالة الماء منه عبر سلسلة متدرجة من كحول الإيثيل. وعلى مدار فترة زمنية تبلغ ستة أسابيع، يُترك الدماغ من ثلاثة إلى خمسة أيام في 50%ethanol، ومن سبعة إلى 10 أيام في 70%ethanol، وحوالي أسبوعين في كل من 85 و 95%ethanol، وبقية الوقت في 100%ethanol. وبعد ثلاث عمليات تغيير لأسيتون في درجة حرارة الغرفة، يتم طمر الدماغ في بلاستيك راتنجي داخل فرن عند درجة حرارة 60 درجة Celsius.

لبدء إجراء صبغ الشبكة الوعائية باستخدام حبر الهند، تأكد من أن الفأر في حالة تخدير عميق من خلال غياب منعكس سحب إصبع القدم. بعد ذلك، قم بإجراء تروية قلبية للفأر باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات بدرجة حرارة الغرفة، يليه فورمالين منظم متعادل بتركيز 10% وبدرجة حرارة الغرفة. تعد التروية الكاملة للجسم بالمحلول الملحي والمثبت ضرورية لتطهير الجهاز القلب الوعائي من الدم وتثبيت الأنسجة.

بعد ذلك، يتم إجراء تروية للفأر باستخدام 3.0 ccs من محلول تروية حبر الهند غير المخفف. يعد استخدام حبر الهند ضرورياً لملء الأوعية الدموية في الجهاز القلبي الوعائي بالكامل. وبعد إزالته من الفأر، يتم تجفيف الدماغ الناتج من خلال سلسلة من الكحولات الإيثيلية المتدرجة ثم يتم تضمينه في بلاستيك إيروديت.

بعد اتباع البروتوكول الموضح سابقًا لإعداد نظام KESM للتصوير، قم بتشغيل الكاميرا والمضاء والمنصة، وارفع السكين والعدسة الشيئية. بعد ذلك، قم بتركيب حلقة العينة. ثم اخفض العدسة الشيئية والسكين.

قس أبعاد العينة. ثم أنشئ ملف تهيئة لوحدة تحكم المنصة في جهاز KESM. ابدأ برفع السكين والعدسة الشيئية لجهاز KESM قبل تهيئة المنصة.

قم بتشغيل وحدة التحكم الثانية في منصة KESM وتهيئتها. ثم اخفض السكين والعدسة الشيئية وقم بتشغيل المضخة. اضبط تركيز العدسة الشيئية والكاميرا عن طريق تدوير مقبض التركيز في القطار البصري وضبط مجال رؤية الكاميرا بالنسبة لحافة السكين.

انقر خطوة بخطوة لمراجعة الخطوات القليلة الأولى من التصوير والتقطيع. ثم انقر "Go" لبدء عملية التصوير والتقطيع من أجل معالجة الصور.

قم بتشغيل معالج حزمة KESM لإزالة العيوب الضوئية وتوحيد كثافة الخلفية في جميع الصور. كرر هذه العملية لجميع المجلدات الفرعية للبيانات. ولتصوير البيانات باستخدام أطلس KESM للدماغ، انتقل إلى هذا الموقع الإلكتروني واختر الأطلس المناسب للانتقال إلى عمق مختلف.

اختر من القائمة المنسدلة مدى العمق المطلوب الوصول إليه في كل خطوة، ثم انقر على علامة الزائد لزيادة عمق Z أو علامة الناقص لتقليله. تشمل الخيارات الأخرى التكبير أو التنقل باستخدام أطلس دماغ KESM. استخدم القائمة المنسدلة لضبط رقم التراكب وفترة التراكب لتصور البيانات باستخدام VIS lab.

قم بتشغيل التطبيق، ثم أنشئ مشروعاً جديداً. يجب أن يتضمن المشروع "compose 3D from 2D files" مع ضبط "world matrix arithmetic" على القيمة one، وربط "view 3D". بهذا الترتيب، ينبغي ضبط المعلمات المناسبة كما هو موضح في "view 3D" أثناء الضغط على زر الفأرة الأيمن.

قم بتحريك الماوس لضبط مناطق العتبة التي يمكن قصها. تم تغيير التوجيه، أو تغيرت الإضاءة، أو تم تشغيل الخلفية أو إطفاؤها. تظهر نتائج KESM التمثيلية من خلال مقاطع الفيديو التالية، حيث تعرض المقاطع الأولى تصورات حجمية لـ KESM، وهي مجموعات بيانات حبر الهند للمخ بأكمله لمجموعة البيانات الوعائية، بدءاً بلقطة مقربة للبيانات الوعائية بعرض يبلغ حوالي 100 microns.

يظهر المقطع الثاني من بيانات KESM لصبغة حبر الهند في الدماغ الكامل ثلاث مناظر قياسية للأوعية الدموية في دماغ الفأر بالكامل، وهي عينات فرعية مأخوذة من بيانات عالية الدقة بعرض يبلغ حوالي 10 millimeters. ويشمل ذلك المنظر السهمي، والمنظر الإكليلي، والمنظر الأفقي، بالإضافة إلى جولة استكشافية عبر المقطع الإكليلي. كما يوضح مقطع الفيديو هذا بيانات Golgi لدماغ الفأر الكامل بتقنية KESM، حيث يعرض جولة استكشافية على طول مستويات القطع الثلاثة المختلفة، بدءاً بمنظر الكتلة، يليه المنظر السهمي، ثم المنظر الإكليلي، وأخيراً المنظر الأفقي.

تظهر فيما يلي تفاصيل بيانات GoGy لكامل دماغ الفأر باستخدام تقنية KESM. يعرض مقطع الفيديو الأول المخيخ وخلايا بوركينجي. بينما يوضح المقطع الثاني القشرة المخية والخلايا الجدارية الجانبية.

أخيرًا، KESM. يتم توضيح بيانات nle للدماغ الكامل في هذين المقطعين من الفيديو. يظهر أولاً لقطة مقربة لبيانات NLE.

يُظهر هذا المقطع الثاني ثلاثة مناظر قياسية لبيانات Nle لدماغ الفأر الكامل، والتي تم أخذ عينات فرعية منها من بيانات عالية الدقة. كما يتم عرض مقطع عرضي لرؤية واضحة للهياكل الداخلية بعد هذا التطوير. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم الأعصاب لاستكشاف الشبكات العصبية والوعائية في دماغ الفأر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لتحضير العينات، والتصوير، وتحليل البيانات الخاصة بالمجهر الماسح ذو الحافة السكينية.