الاستقراء والرصد من فرط الحساسية المتأخرة نوع بالتبني في الفئران

أنا كريستيان بيتون. أنا باحثة مساعدة في مختبر جورج تشين في قسم علم وظائف الأعضاء والبيوفيزياء بجامعة كاليفورنيا في ايرفين. وفي الأيام القليلة المقبلة، سأوضح لك إجراء تحريض وقياس تفاعل DTH التكيفي في فئران لويس.

لذا فإن هذا الإجراء يستغرق خمسة أيام وما سأوضحه لك هو كيفية تنشيط الخلايا التائية المحددة للمستضد، ثم حقنها بعد يومين في فئران ساذجة. ثم بعد يومين، سنقوم بتحدي الفئران في الأذنين بالمستضد الذي تكون هذه الخلايا التائية متخصصة فيه. وبعد يوم واحد، سنقوم بقياس درجة الالتهاب في تلك الفئران.

للحصول على المصل لزراعة الأنسجة، أحتاج إلى الحصول على الدم. لذلك أقوم ببزل القلب. أضع سبابتي اليسرى على الضفيرة الشمسية وأصل إلى القلب عبر الأضلاع، بين الأضلاع بإبرة وأسحب أكبر قدر ممكن من الدم.

ومن سحبة واحدة، اعتمادًا على اليوم والكفاءة، يمكننا الحصول على ما بين 2 إلى 10 ملل من الدم من فارة معينة. والسبب في أننا نحتاج إلى المصل في الثقافة، نريد أن نزرع الخلايا التي هي خلايا فارة لويس في مصل متماثل. لذلك ستكون مصل فارة لويس.

ثم أنقل الدم إلى أنبوب، لكنني أكون حريصًا على إزالة الإبرة من الحقنة حتى لا يحدث انحلالي الدم لأنني أريد استخدام مصل لزراعة الأنسجة. لاحقًا. الآن سأقوم بإزالة الغدة الصعترية لأن القلب قد توقف عن النبض والفارة ماتت.

لذا فإنني أرش أولًا بـ 70٪ من الإيثانول للتأكد من عدم وجود شعر يدور حوله ويدخل إلى عضوي لأنني أحتاجه لزراعة الأنسجة. وأستخدم أدوات معقمة لإجراء التشريح. لذا فإنني أولًا أقطع الجلد.

بمجرد أن أزلت الجلد، أقوم بقص دقيق على جانبي القفص الصدري للتأكد من أنني لا ألحق الضرر بالغدة الصعترية التي تقع فوق القلب مباشرة. ويمكن رؤية الغدة الصعترية هنا كعضو شاحب، تقريبًا أبيض، يقع فوق القلب. لذا فإنني أزيلها، وأتأكد من أنني آخذ العضو بأكمله، لكنني لست حريصًا جدًا في إخراجه بشكل نظيف لأنني سأقوم بتنظيفه في الدخان لاحقًا.

وأقوم بوضعه ببساطة في أنبوب يحتوي على PBS قمت بإضافته بالبنسلين والستربتومايسين. لتجنب أي نمو بكتيري، سأقوم الآن بإعداد تعليق خلية واحدة من الخلية. ولهذا سأستخدم مصفاة خلية 70 ميكرون.

وبالطبع، سأستخدم جميع المعدات المعقمة. أنقل الغدة الصعترية إلى طبق بتري. وكما ترون، فهي ليست نظيفة جدًا.

الغدة الصعترية هي العضو الأبيض وهناك عقد ليمفاوية وتكتل دموي عليها. لذا فإنني سأقوم بإزالتها. وأقوم بوضع حوالي 10 ملل من PBS المضاف إليه المضادات الحيوية في مصفاة الخلايا لتكون جاهزة لاستقبال الغدة الصعترية بمجرد تنظيفها.

لتنظيفها، أقوم ببساطة بإزالة جميع الملوثات من الغدة الصعترية. الآن أصبحت الغدة الصعترية نظيفة تقريبًا، لذا فإنني سألتقطها بملقط وقصها إلى قطع صغيرة بمقص فوق مصفاة الخلايا ووضع كل القطع الصغيرة من الغدة الصعترية داخل مصفاة الخلايا. وبعد الانتهاء من ذلك، سأستخدم مكبس حقنة واحد ملل، وهو معقم بالطبع، لإعداد تعليق الخلايا المفردة عن طريق ضغط قطع الغدة الصعترية من خلال مصفاة الخلايا.

وستأتي الخلايا المفردة وتصبح في PBS خارج مصفاة الخلايا. لذا فإنني قمت بضغط خلاياي من خلال مصفاة الخلايا وترونها أن PBS لم يعد واضحًا. إنه مملوء بتعليق الخلايا المفردة الذي سأنقله إلى أنبوب 50 ملل أبقيه على الجليد.

وسأكرر الإجراء عدة مرات عن طريق إعادة ملء مصفاة الخلايا بـ PBS والضغط أكثر مع مكبس الحقنة ونقلها إلى أنبوبي حتى أحصل على ما بين 30 و 40 ملل من PBS في أنبوبي. وهذا هو شكل مصفاة الخلايا بعد انتهائي. الآن بعد أن جمعت جميع الخلايا، سأقوم بفصلها لمدة 10 دقائق تقريبًا عند 1200 دورة في الدقيقة.

إليك الخلايا التي أخذتها من جهاز الطرد المركزي والحبة كبيرة، وهو ما هو متوقع من مرة واحدة. الآن سأتخلص من المصل. لذا فإن الحبة بالطبع ستظل في أسفل الأنبوب. ولجعل التعليق أكثر سهولة، سأقوم بكسر PT بينما لا يزال جافًا تقريبًا.

ولهذا، أقوم بضربه بإصبعي بقوة حتى ترون أن PT قد تم تفكيكه تمامًا وعادنا إلى تعليق خلية مفردة. الآن سأقوم بإعادة تعليق خلاياي في PBS المعقم الخاص بي وأضف 5 ملل من PBS لكل خلية. وبما أن لدي خلية واحدة فقط، فإنني أضف 5 ملل.

وهذا هو التعليق الذي سأحضره إلى المرطب للشفاء. ومستوى الري الذي أستخدمه هو 30 درجة للتأكد من أن الخلايا لا تزال حية ولكنها ستموت في غضون ساعات قليلة. لذا فإنها لا تزال قادرة على معالجة المستضد، لكنها لن تلوث ثقافتي.

إذا نظرنا إلى الخلايا التائية التي نريد تنشيطها، فنحن نرى أنها لا تبدو صحية على الإطلاق. لقد بدأت بعضها في الموت. لديها أشكال غريبة، لم يعد يوجد.

لذا فإن هذه الخلايا جاهزة للتنشيط. إنها في الواقع بحاجة ماسة إلى المستضد بعد الأوقات. من المهم جدًا غسلها بسرعة لأن بعضها سيموت وسيطلق مركبات سامة في المحلول.

لذا فإنني أضيف، أكمل الأنبوب إلى 50 ملل بمحلول PBS. وفي الوقت نفسه، سأقوم بنقل الخلايا التائية التي تنتظر التحفيز. سأنقلها إلى أنبوب 50 ملل آخر حتى أتمكن من إرسال كل من الأنبوبين في نفس الوقت.

إليك الدم الذي جمعته منذ لحظات قليلة، وتركته لمدة 10 دقائق عند 37 درجة ثم وضعته على الجليد. وكما ترون، قد تكاثرت تمامًا. لذا فإنني بحاجة إلى المصل من هذا الدم.

لجمعه في الخطوة الأولى باستخدام ماصة معقمة، سأقوم بإزالة التخثر من الأنبوب وسأقوم بجمع كل السائل الذي يحتوي على المصل الذي أهتم به. وكذلك بعض الخلايا التي لم تكن محاصرة في التخثر. وهذا السائل، سأقوم بنقله إلى أنبوب آخر أثناء النقل، وأحيانًا تأتي قطع صغيرة من التخثر، لكن هذا ليس مشكلة كبيرة لأنني أحتاج إلى إزالة الخلايا التي لا تزال في هذا السائل.

لذا فإنني سأقوم بفصل الدم الصغير الموجود في الأنبوب. لذا فإن ذلك سيزيل الخلايا وأي قطعة من التخثر تأتي معها، سأقوم الآن بتدوير الجزء السائل من الدم لفصل الخلايا عن المصل. لذا فإن الدوران لمدة دقيقتين سيكون كافيًا.

الآن تم فصل المصل، لذا فإنني سأقوم بإزالة المصل من الخلايا. هذا ليس مثالًا مثاليًا لأن المصل يجب أن يكون أصفر اللون وهذا أحمر اللون مما يدل على أنني عانيت من انحلالي الدم. لذا فإن هذا ليس مثاليًا تمامًا، لكنني سأوضح لك كيف سأقوم بتصفيته.

استخدمت حقنة مطاطية 0.2 ميكرون، فلتر مكيف، وقمت بتصفية المصل للتأكد من أنه معقم. ولكن بما أنني عانيت من انحلالي الدم، فلن أستخدم هذا المصل لتحفيزي. سأستخدم مصل فارة لويس الذي تم تجميده خلال تجربة سابقة.

هذه هي الخلايا التائية PT على اليسار وخلايا تقديم المستضد على اليمين. الآن سأتخلص من السنا من كلا الأنبوبين. وكما في السابق، سأقوم بكسر الحبتين بالضرب بإصبعي للتأكد من أن الخلايا عادت إلى تعليق خلية مفردة.

وسأفعل ذلك لكل مجموعة من الخلايا، الخلايا التائية