الاستقراء والرصد من فرط الحساسية المتأخرة نوع بالتبني في الفئران

أنا كريستين بيتون، باحثة مساعدة في مختبر جورج تشن في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا في إيرفاين. وسأعرض لكم خلال الأيام القليلة القادمة إجراءات تحفيز وقياس استجابة فرط الحساسية المتأخرة (DTH) التكيفية في جرذان لويس.

تستغرق هذه العملية خمسة أيام، وسأوضح لكم كيفية تنشيط الخلايا التائية النوعية للمستضد، ثم كيفية حقنها بعد يومين في جرذان سليمة. وبعد ذلك بيومين، سنقوم بتحدي الجرذان في الأذنين باستخدام المستضد الذي تكون تلك الخلايا التائية نوعية له. ثم بعد يوم واحد، سنقوم بقياس درجة الالتهاب في تلك الجرذان.

للحصول على المصل من أجل زراعة الأنسجة، أحتاج إلى سحب الدم. وللقيام بذلك، أجري عملية بزل للقلب؛ حيث أضع سبابة يدي اليسرى على الضفيرة الشمسية، ثم أصل إلى القلب عبر الأضلاع، وتحديداً بين الضلوع باستخدام الإبرة، وأسحب أكبر كمية ممكنة من الدم.

ومن سحب واحد، وبناءً على اليوم وكفاءة العملية، يمكننا الحصول على ما بين 2 و 10 mils من الدم من جرذ معين. والسبب في حاجتنا للمصل في المزرعة هو أننا نريد تنمية خلايا من جرذان Louis في مصل يكون متجانسًا جينيًا (syngeneic)، لذا سيكون هذا مصل جرذان Louis.

بعد ذلك، أنقل الدم إلى أنبوب، مع الحرص على إزالة الإبرة من المحقنة لتجنب حدوث انحلال الدم، لأنني أريد استخدام المصل في زراعة الأنسجة لاحقاً. والآن سأقوم باستئصال الغدة الزعترية بما أن القلب قد توقف عن النبض ومات الجرذ.

لذا أقوم أولاً بالرش بـ 70%ethanol للتأكد من عدم وجود شعر يتطاير ويدخل في العضو، لأنني أحتاجه لاستزراع الأنسجة. وأستخدم أدوات معقمة بالأتوكلاف لإجراء التشريح. لذا أقوم أولاً بقص الجلد.

بمجرد إزالة الجلد، أقوم بالقص بعناية على كل جانب من القفص الصدري للتأكد من عدم إتلاف الغدة الزعترية الموجودة فوق القلب مباشرة. ويمكن رؤية الغدة الزعترية هنا كعضو باهت، يكاد يكون أبيض اللون، يقع فوق القلب مباشرة. لذا أقوم بإزالتها، مع الحرص على استئصال العضو بالكامل، ولكنني لا أبالغ في الدقة عند إخراجها بشكل نظيف لأنني سأقوم بتنظيفها في خزانة التدفق الصفائحي (the hood) لاحقاً.

أقوم ببساطة بوضعها في أنبوب يحتوي على PBS مضاف إليه البنسلين والستريبتومايسين. ولتجنب أي نمو بكتيري، سأقوم الآن بتحضير معلق خلوي أحادي من الخلايا. ولتحقيق ذلك، سأستخدم مصفاة خلايا بمسام 70 ميكرون.

وسأستخدم بالطبع جميع المعدات المعقمة. أقوم بنقل الغدة الزعترية إلى طبق بتري. وكما تلاحظون، فهي ليست نظيفة تماماً.

الغدة الزعترية هي العضو المائل للبياض، وهناك عقد لمفاوية وتجلطات دموية عليها، لذا سأقوم بإزالتها. وسأضع حوالي 10 mL من PBS المدعم بالمضادات الحيوية في مصفاة الخلايا لتكون جاهزة لاستقبال الغدة الزعترية بمجرد تنظيفها.

ولتنظيفه، أقوم ببساطة بإزالة جميع الملوثات من الغدة الزعترية. الآن أصبحت الغدة الزعترية نظيفة تماماً تقريباً، لذا سأقوم بالتقاطها باستخدام الملقط وقصها إلى قطع صغيرة بالمقص فوق مصفاة الخلايا، ثم أضع جميع قطع الغدة الزعترية الصغيرة داخل مصفاة الخلايا. وبعد الانتهاء من ذلك، سأستخدم مكبس حقنة سعة 1 mL، وهي معقمة بالطبع، لإعداد معلق من الخلايا المفردة عن طريق ضغط قطع الغدة الزعترية عبر مصفاة الخلايا.

وستمر الخلايا المفردة لتصبح في محلول PBS خارج مصفاة الخلايا. الآن، قمت بضغط الخلايا عبر مصفاة الخلايا، ويمكنكم ملاحظة أن محلول PBS لم يعد شفافاً، بل أصبح مليئاً بمعلق الخلايا المفردة الذي سأقوم بنقله إلى أنبوب سعة 50 مل أحفظه على الثلج.

سأقوم بتكرار هذه العملية عدة مرات عن طريق إعادة ملء مصفاة الخلايا بـ PBS والضغط مجدداً بمكبس المحقنة ونقل السائل إلى الأنبوب الخاص بي حتى أحصل على كمية تتراوح بين 30 و 40 mil من PBS في الأنبوب. وهذا هو مظهر مصفاة الخلايا بعد الانتهاء. والآن، بعد أن جمعت كافة الخلايا، سأقوم بتركيزها عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق تقريباً بسرعة 1200 RPM.

إليك الخلايا التي أخرجتها من جهاز الطرد المركزي، وكما هو متوقع في هذه المرحلة، فإن الراسب كبير جداً بعد التخلص من السائل الطافي. وبالطبع، لا يزال الراسب مستقراً في قاع الأنبوب. ولتسهيل عملية إعادة التعليق، سأقوم بتفكيك الراسب وهو لا يزال شبه جاف.

وللقيام بذلك، أقوم بالنقر عليه بإصبعي بقوة حتى يظهر أن الورم thymus قد تفكك تماماً، وبذلك نعود إلى تعليق من الخلايا المفردة. سأقوم الآن بإعادة تعليق خلاياي في محلول PBS معقم، حيث أضيف 5 mL من PBS لكل thymus. وبما أن لدي thymus واحداً فقط، سأضيف 5 mL فقط.

وهذا هو المعلق الذي سأنقله إلى جهاز الري. ومستوى الري الذي أستخدمه هو 30 درجة للتأكد من أن الخلايا لا تزال حية ولكنها ستموت في غضون ساعات قليلة. وبذلك تظل قادرة على معالجة المستضد، ولكنها لن تلوث المزرعة الخاصة بي.

إذا ألقينا نظرة على الخلايا التائية التي نرغب في تنشيطها، سنلاحظ أنها لا تبدو صحية على الإطلاق؛ حيث بدأت بعضها في الموت، كما أنها اكتسبت أشكالاً غريبة ولم تعد موجودة.

وبذلك تكون هذه الخلايا جاهزة للتنشيط، فهي في الواقع في أمسّ الحاجة إلى المستضد بعد هذه الفترة الزمنية. ومن المهم للغاية غسلها بسرعة لأن بعضها سيكون قد مات وسيقوم بإطلاق مركبات سامة في المحلول.

لذا سأقوم بإضافة محلول PBS لاستكمال حجم الأنبوب حتى 50 mL. وفي الوقت ذاته، سأنقل الخلايا التائية (T-cells) التي تنتظر التحفيز إلى أنبوب آخر سعة 50 mL، حتى أتمكن من وضع كلا الأنبوبين في جهاز الطرد المركزي في آن واحد.

إليكِ عينة الدم التي جمعتها منذ فترة وجيزة، وقد تركتها لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ثم وضعتها على الثلج. وكما ترون، فقد تكلب الدم تماماً. لذا أحتاج إلى استخلاص المصل من هذا الدم.

لذلك، وفي الخطوة الأولى، سأستخدم ماصة باستور معقمة لفصل الجلطة عن أنبوب الاختبار وجمع كل السائل الذي يحتوي على المصل المطلوب، بالإضافة إلى بعض الخلايا التي لم تُحتجز داخل الجلطة. سأقوم بنقل هذا السائل إلى أنبوب آخر، وأثناء عملية النقل، قد تنتقل أحياناً قطع صغيرة من الجلطة، ولكن هذا لا يشكل مشكلة كبيرة لأنني سأحتاج على أي حال إلى إزالة الخلايا التي لا تزال موجودة في هذا السائل.

سأقوم الآن بطرد مركزي للأنبوب الصغير الذي يحتوي على السائل، وذلك لإزالة الخلايا وأي قطع من الجلطات الموجودة. سأقوم بتدوير الجزء السائل من الدم لفصل الخلايا عن المصل، وسيكون التدوير لمدة دقيقتين كافياً.

الآن بعد أن تم تدوير المصل، سأقوم بفصله عن الخلايا. هذا المثال ليس مثالياً لأن المصل يجب أن يكون مائلاً للاصفرار، بينما يظهر هذا المصل باللون المائل للاحمرار مما يشير إلى حدوث تحلل دموي. لذا، فإن هذه العينة ليست مثالية تماماً، ولكنني سأوضح لكم على أي حال كيفية ترشيحه.

أستخدم مرشح حقنة بمسامية 0.2 ميكرون، وهو مرشح مهيأ، وسأقوم بترشيح المصل الخاص بي للتأكد من تعقيمه. ولكن نظرًا لحدوث تحلل دموي، فلن أستخدم هذه الدفعة من المصل في عملية التحفيز، بل سأستخدم مصل جرذ Louis الذي تم تجميده خلال تجربة سابقة.

تظهر هنا أنابيب الاختبار الخاصة بالخلايا التائية على اليسار والخلايا العارضة للمستضد على اليمين. سأقوم الآن بالتخلص من السائل الطافي من كلا الأنبوبين. وكما فعلت سابقاً، سأقوم بتفكيك الرواسب عن طريق النقر بأصبعي للتأكد من عودة الخلايا إلى حالة المعلق الخلوي الأحادي.

وسأقوم بذلك لكلتا مجموعتي الخلايا، الخلايا التائية والخلايا المقدمة للمستضد. بعد ذلك، سأقوم بتعليقهما ثم عدهما. بعد ذلك، سأقوم بخلط 3 مليون من الخلايا التائية مع 150 مليون من الخلايا المقدمة للمستضد، وسأضعهما في أطباق بتري بقطر 10 سنتيمتر.

وفي حجم إجمالي قدره 10 mils، يوجد هنا أنبوبان من المصل. والأنبوب الموجود على اليمين هو الذي قمت بتحضيره اليوم، ولونه مائل للاحمرار بسبب التحلل الدموي، بينما الأنبوب الموجود على اليسار هو الذي حضّرته قبل بضعة أيام وحفظته مجمداً. لونه مائل للاصفرار، ولا يوجد به تحلل دموي، وهو أفضل بكثير.

هذا هو الوسط الذي سأستخدمه لزراعة الأنسجة اليوم. لدي عدد كافٍ من الخلايا لتحفيز ستة أطباق بتري، لذا سأضع 30 mils من الوسط في الخلايا المقدمة للمستضد و 30 mils من الوسط نفسه في الخلايا التائية. وبعد ذلك، سأقوم بإضافة المستضد، وهو ألبومين، إلى أنبوب الخلايا المقدمة للمستضد.

إن تركيز المحلول المخزني لدي هو 1 mg/mL، وأريد أن يكون التركيز النهائي في أطباق بتري 10 µg/mL. وبالنسبة للخلايا التائية T-cell، سأضيف مصل جرذ لويس. وسأضيف كمية كافية بحيث يكون التركيز النهائي لمصل الجرذ في أطباق بتري 1%.

سأقوم بتجنيس معلق الخلايا المقدمة للمستضد، ثم سأنقل 5 mL من هذا المعلق الخلوي إلى كل طبق بتري. عند إخراج معلق الخلايا المقدمة للمستضد، ستلاحظ دائمًا وجود كتلة صغيرة من الدهون والأنسجة الليفية، وهذا أمر طبيعي تمامًا.

إنها تظهر دائمًا خلال جميع مراحل تحضير الموقع. ولا داعي للقلق بشأنها؛ لذا فإنني إما أن أتخلص منها إذا تمكنت من ذلك، أو أتركها في طبق بتري.

لا يؤثر ذلك على المزرعة الخلوية إطلاقاً. وبمجرد نقل جميع الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) إلى أطباق بتري، سأقوم بتكرار الإجراء مع الخلايا التائية (T-cell). لذا، سأضع 5 mL من معلق الخلايا التائية في كل من أطباق بتري تلك.

الآن أصبحت جميع الخلايا في أطباق بيتري، ومن المهم جداً خلطها جيداً لضمان حصول جميع الخلايا التائية T-cell على فرصة للتلامس مع خلية مقدمة للمستضد. ولتحقيق ذلك، أقوم بتكديس أطباق بيتري وأخلطها عن طريق رسم رقم ثمانية وهمي بالأطباق. وأكرر هذه العملية عدة مرات للتأكد من أن جميع الخلايا قد خُلطت جيداً.

وبمجرد الانتهاء من جميع عمليات الخلط، سأضع هذه الأطباق في حاضنة في جو رطب عند 37 °C و5%CO2. لقد بقيت في الحاضنة لمدة 48 ساعة. لقد تغير لون الوسط قليلاً، حيث أصبح مائلاً للبرتقالي الآن، وقد تم تنشيط الخلايا بشكل جيد.

لذا أقوم بفحص جميع أطباق بتري واحدًا تلو الآخر تحت المجهر. وبذلك تكون الخلايا الكبيرة جدًا هي الخلايا التائية المنشطة، بينما تكون الخلايا الصغيرة جدًا هي الخلايا المقدمة للمستضد الميتة. والتحفيز جيد حقًا لأنه يمكن ملاحظة أن الخلايا التائية ضخمة.

وإذا حركت طبق بيتري قليلاً، عذراً، كما ترون هنا على الجانب الأيسر، والآن في المركز، توجد كتلة كبيرة من الخلايا، وهي خلايا تنقسم بنشاط. لذا سأقوم الآن بوضع جميع الخلايا في أنابيب طرد مركزي لتمكين تدويرها وترسيبها، ثم عدّها، وبعد ذلك حقن 10 مليون منها في الجرذان. لقد كان التحفيز جيداً للغاية، لدرجة أنني لا أحتاج إلى كل هذه الخلايا التائية (T cells) لحقن جرذ واحد.

لذا، سأقوم باستخدام الخلايا من طبقين فقط من أطباق بتري. سأقوم بدورانها (طرد مركزي) لفصلها من أجل حقن 10 million، بينما سأضع بقية الخلايا في المزرعة لتجميدها خلال أيام قليلة.

أما وسط الزرع فهو وسط زرع الخلايا التائية (T-cell) المعتاد مع إضافة عامل نمو الخلايا التائية ومصل الخيول. وبما أن الخلايا التائية غير ملتصقة، فلا أحتاج إلى القيام بالكثير؛ فقط أتأكد من انتقال معظم الخلايا مع الوسط.

وبعد ذلك، سأقوم في النهاية بشطف جميع أطباق بترى بوسط غذائي جديد للتأكد من استخراج جميع الخلايا. سأستخدم 10 mL من الوسط، وهو نفس الوسط الذي استخدمته للتحفيز، وأعتقد أن كل طبق بترى، لكن الخلايا التائية تكون قد خرجت بالفعل في المرة الأولى التي سحبت فيها الوسط. لذا، فعادةً ما يخرج الوسط من أطباق بترى، وهذا ليس ضرورياً تماماً، ولكن نظراً لأن هذه الخلايا ثمينة، فلا أريد أن أفقد أي منها.

لذلك سأقوم بطردها مركزياً. سيؤدي ذلك إلى إزالة بعض الخلايا الميتة والبدء بشكل أساسي بتلك الخلايا. وأرغب في تزويدها بوسط غذائي جديد.

لذا سأقوم مرة أخرى بالتدوير بسرعة 1,500 RPM لمدة ثماني دقائق تقريباً. وسأبقي على تفعيل المكابح لأنني أقوم فقط بترسيب الخلايا. لذا نقوم بالنظر في كلا الأنبوبين، وفي أحدهما أجد كريات صغيرة.

هذا ناتج عن طبقين من أطباق بتري. وهنا الراسب الناتج عن أربعة أطباق بتري. وتظهر الرواسب بحجم كبير لأنها لا تحتوي على الخلايا التائية المنشطة فحسب، بل تحتوي أيضاً على الخلايا المقدمة للمستضد.

سأقوم الآن بتفريغ السائل الطافي، وسأضيف إلى الخلايا التي سأحقنها هنا 1 mL من الوسط، وهو ما سأستخدمه للحقن. أما الخلايا الأخرى، فسأقوم بتعليقها في 100 mL من وسط استنبات يحتوي على عامل نمو الخلايا التائية ومصل الخيول. وهذه هي الخلايا التي سأقوم بحقنها.

وبالنسبة لهذه الخلايا، سأقوم بوضعها في قارورتين بلاستيكيتين سعة كل منهما 50 مل. لذا، سأضع في كل قارورة 10% من عامل نمو الخلايا التائية (T-cell growth factor)، وهو من صنع العظام. كما سأضيف 10% من مصل الخيول المنشط حرارياً.

بعد ذلك، سأضيف معظم الوسط الذي أحتاجه. لن أقوم بسحبه وإطلاقه بواسطة الماصة بشكل متكرر لأن الخلايا التائية (T cells) تتأثر سلباً بعمليات السحب المتكررة بالماصة. لذا، سأقوم بسحب الحد الأدنى الضروري للغاية من الكميات، ثم أقوم بإكمال الإضافة وتصبح الخلايا جاهزة.

لقد أصبحت جاهزة للوضع في الحاضنة، وسأقوم بفحصها يومياً. من المرجح أنني سأحتاج إلى تقسيمها بعد 24 ساعة، وإذا لم يحدث ذلك، فبالتأكيد بعد 40 أو 48 ساعة. لكنني سأقوم بفحصها كل يوم.

تميل هذه الخلايا إلى النمو بسرعة كبيرة عند استخدام عامل نمو الخلايا التائية (T-cell growth factor). لذا، يجب تقسيمها كل 48 ساعة على الأقل، وربما في وقت أقصر من ذلك. سأقوم أيضاً بفحص لون الوسط الزرعي.

لقد تم تنشيطها الآن، لذا فهي في حالة تنشيط كامل. وهذا هو الوقت الأمثل لحقنها في الجرذ. وبعد يومين، سنقوم بتحفيز الجرذ في الأذن.

إذا انتظرنا عودة الخلايا إلى حالة الراحة لعدة أيام، فإنها ستتوجه إلى موقع الالتهاب بسرعة كبيرة. لذا، سأقوم الآن بوضعها في الحاضنة عند 37 °C مع 5% CO2، وسأستخدم إبرة مقاس 25 gauge لحقنها في الجرذ. والآن بعد أن تم حقن الخلايا في الجسم، سأترك الجرذ هنا وسأقوم بتحفيزه في الأذنين بعد 48 ساعة.

منذ عدة أيام، قمت بحقن خلايا تائية متخصصة في الألبومين وموسومة بـ GFP في جرذ سليم. واليوم، سأقوم بتحفيز الجرذ ذاته في الأذن؛ حيث سأحقن الألبومين في الأذن اليمنى.

وفي الأذن اليسرى سأقوم بحقن some PBS. جرعة volin التي سأحقنها هي 20 micrograms في 20 µL. أما albumin الذي أستخدمه فهو خليط بنسبة واحد إلى واحد من albumin مُوسوم بـ Texas red و albumin غير مُوسوم.

هذا هو الجزء العلوي من الأذن الذي سأوضح لكم من خلاله كيفية إجراء الحقن. بما أنني أيمن، سأستخدم يدي اليسرى؛ لقد نزعت القفاز عن يدي اليسرى لأتمكن من وضع إصبع تحت صيوان الأذن والإصبع الآخر فوقه لشد الجلد، وذلك حتى أتمكن من رؤية موضع الإبرة بدقة والدخول بين طبقتي الجلد في منطقة الصيوان، وهي منطقة رقيقة للغاية.

لذلك، أستخدم إبرًا بقياس 27 gauge للحصول على أداة رفيعة للغاية للإدخال. وعندما أقوم بتدويرها، ستلاحظون بوضوح أين ذهب صبغ Texas red وأين ذهب محلول PBS. لقد مر الآن 42 ساعة على عملية التحدي في الأذن، وسأستخدم ميكرومترًا يعمل بنظام الزنبرك لقياس سمك الأذن.

سأقوم بقياس كلتا الأذنين، الأذن اليمنى التي تعرضت للتحدي ببروتين الألبومين، والأذن اليسرى التي لم تتعرض للتحدي. وسيعطينا الفرق في سمك الأذن فكرة عن شدة الالتهاب. وبذلك، فقد عرضت لكم هنا الإجراء الكامل لإجراء اختبار فرط الحساسية المتأخر التكيفي (adaptive DTH) في الجرذان.

لقد أوضحتُ لكم كيفية تنشيط الخلايا التائية النوعية للمستضد في المختبر، وكيفية نقلها تكيفيًّا إلى داخل الجرذان، ثم كيفية تحفيز تلك الجرذان وقياس درجة الالتهاب. نحن في مختبر "تشانْد" نستخدم هذا الإجراء بشكل روتيني لاختبار تأثير حاصرات قنوات البوتاسيوم على الالتهاب في الجرذان.