تغليف الخلايا العضلية في هيدروجيل الفايبرين للهندسة الأنسجة القلبية

نحن تصف عزلة العضلية الولدان وإعداد الخلايا للتغليف في بنيات هيدروجيل الليفين للهندسة الأنسجة. نحن تصف طرق لتحليل الأنسجة المهندسة عضلة القلب بعد فترة الثقافة بما في ذلك إنشاء قوة فاعلة على التحفيز الكهربائي وبقاء الخلية ، وتلطيخ immunohistological.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تغليف خلايا عضلة القلب في الفئران حديثي الولادة في هيدروجيل FI لهندسة أنسجة القلب. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل قلوب صغار الفئران حديثي الولادة التي تتراوح أعمارها بين يومين وثلاثة أيام. بعد ذلك ، يتم هضم القلوب في الكولاجيناز.

لفصل خلايا القلب عن المصفوفة خارج الخلية ، يتم تغليف خلايا القلب في هيدروجيل الفيبرين. أخيرا ، يتم استزراع التركيبات لمدة أسبوعين. في النهاية ، تظهر النتائج أن التركيبات لديها القدرة على توليد قوة ارتعاش تبلغ حوالي 1.3 مللي نيوتن استجابة للتحفيز الكهربائي.

علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة البنية المحاذاة للبناء من خلال التلوين النسيجي من بروتينات الخلايا العضلية. يمكن أن تكون تركيبات عضلة القلب الهندسية بمثابة علاج محتمل لاحتشاء عضلة القلب من خلال السماح بإصلاح أو استبدال الأنسجة المتندبة بأنسجة هندسية ، وبالتالي تحسين وظائف القلب ، بعد الإصابة أو المرض. يمكن أن تكون هذه التركيبات بمثابة نظام نموذج قيم في المختبر لدراسة تأثيرات المحفزات المختلفة على قوى الانقباض وتطور القلب الطبيعي والفيزيولوجي المرضي.

بعد تحضير أدوات جراحية متوسطة ومعقمة لكل شخص ، ضع وسادة سفلية ماصة على غطاء المحرك ، وسطح العمل وقم بتغطيتها بستارة معقمة. ضع الأدوات الجراحية المعقمة ووسادة شاش أربعة × أربعة على الستارة المعقمة. دون لمس الأدوات ، افتح شفرة مشرط معقمة رقم 20 وضعها على الستارة.

بعد قطع رأس الجرو ، امسح الصدر بشاش مبلل بالبيتادين. قم بتأمين الجرو عن طريق الضغط على لوحي الكتف معا. قم بإجراء بضع الصدر الجزئي لكشف القلب ، وزيادة الضغط المطبق على لوحي الكتف ، مما يجبر القلب على تجاوز الأضلاع.

لتشريح الكتف ، قم بتشغيل شفرة المشرط خلف القلب لقطع الأوعية الكبيرة وإزالة العضو. ضع القلب على الثلج في طبق بتري يحتوي على جلوكوز PBS. بمجرد عزل القلوب ، قم بإزالة أي دم متبقي ونسيج ضام عن طريق شطفها في جلوكوز PBS المثلج.

قم بإزالة الثلث العلوي من كل قلب ، بحيث يبقى الثلثان السفليان. لعزل غالبية أنسجة البطين فقط ، ووضع الأنسجة في طبق بتري طازج مع جلوكوز PBS المثلج. باستخدام مقص دقيق معقم وملقط ، قم بفرم القلوب بعناية إلى قطع ملليمتر مكعب تقريبا.

انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بإزالة كل المخزن المؤقت باستثناء 10 مل. أضف سبعة ملليلتر من محلول الكولاجيناز. رج خليط أنسجة الكولاجيناز على حرارة 37 درجة مئوية لمدة سبع دقائق.

مرر الماصة برفق 10 مرات لتفتيت قطع الأنسجة. اترك القطع تستقر ثم استنشق السائل وتخلص منه. أضف سبعة ملليلتر من الكولاجيناز إلى قطع الأنسجة وهضمها مرة أخرى لمدة سبع دقائق.

لكل خطوة متبقية، قم ببرفق 10 مرات لتفتيت قطع الأنسجة. بعد أن تستقر ، اسحب المادة الطافية واجمعها في أنبوب مخروطي منفصل سعة 50 مليلتر ، أضف سبعة ملليلتر من الكولاجيناز إلى قطع الأنسجة وهضمها مرة أخرى لمدة سبع دقائق. إلى كل أنبوب طافي ، أضف 10 ملليلتر من محلول التوقف مع ماصة مصلية مختلفة بعد كل إضافة للمادة الطافية من الهضم.

للتحضير لصب تركيبات هلام الفيبرين ، يرجى الرجوع إلى الجزء المكتوب من البروتوكول. ضع المغزل الذي تم إنشاؤه مسبقا في أغلفة المحاقن الستة سم مكعب باستخدام المحقنة الثلاثة سم مكعب كمكبس للحصول على ختم محكم بين الحلقات O وغسالات التفلون. لصنع مليلتر واحد من هلام الفيبرين ، قم بإنشاء محلول F في أنبوب مخروطي عن طريق إضافة 112 ميكرولتر من مخزون الفيبرينوجين إلى 558 ميكرولتر من أكوام 20 ملليمول.

عازلة في محلول ملحي 0.9٪ في أنبوب مخروطي منفصل. قم بإنشاء محلول T عن طريق إضافة 17 ميكرولتر من مخزون الثرومبين و 1.3 ميكرولتر من محلول الكالسيوم العادي إلى 135 ميكرولتر من DMEM. في أنبوب مخروطي ثالث ، قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليقها إلى تركيز 29.4 مليون خلية لكل مليلتر ، أو ستة أضعاف تركيز التركيز النهائي المطلوب للخلايا في البناء.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة مع خطوة تصنيع البناء. بعد خلط محاليل الفيبرينوجين والثرومبين معا ، تحدث بلمرة الفيبرين بسرعة. وبالتالي ، يجب على الأفراد العمل بسرعة لضمان حل متجانس مع منع دمج فقاعات الهواء في الهيدروجيل عند الحقن في صب القالب.

عندما تكون جاهزا لصب هيكل هلام الفيبرين ، قم بإعداد حقنة سعة مليلتر واحد بإبرة قياس 18 بوصة ونصف. جهز إبرة قياس 21 بوصة واحدة أيضا. لعمل مليلتر واحد من محلول هلام الفيبرين ، أضف 667 ميكرولترا من محلول F في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر ، متبوعا ب 167 ميكرولترا من محلول الخلية.

وأخيرا ، 167 ميكرولتر من محلول T. ماصة الخليط بعناية حتى لا تدخل فقاعات الهواء. في هذه المرحلة ، بدأ التفاعل ويجب أن يتم حقن البناء على الفور.

استخدم المحقنة وإبرة قياس 18 وارسم محلول الفيبرين. احرص على عدم قلب المحقنة لمنع الفقاعات من الدخول إلى الإبرة. استبدل إبرة قياس 18 بإبرة قياس 21.

اضغط على المحقنة برفق لإخراج أي فقاعات هواء. بعد ذلك ، أدخل حقنة في القالب بين غلاف السدادة بعد الأخدود في حلقة التفلون O وحقن المحلول في القالب. قم بإمالة القالب لضمان التعبئة الكاملة.

ثم املأ القوالب المتبقية. لف القوالب في فيلم para في مجموعات من ثلاثة ، وضعها في الحاضنة أو الفرن على حرارة 37 درجة مئوية. احتضن المواد الهلامية لمدة 20 دقيقة للسماح للفيبرين بالوقت الكافي للبلمرة الكاملة.

املأ كل جرة استزراع ب 21 مل من وسط بناء عضلة القلب لكل بناء. استخدم غلاف المحقنة المعقم بثلاثة سم مكعب كمكبس لإجبار المغزل مع البناء في طبق بتري كبير مع DMEM. ثم ضع البناء في جرة العينة.

احتضن البرطمانات عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين. لبدء تحليل مشبك بناء الفيبرين ، يتم تثبيت التمساح على الرصاص القادم من المحفز إلى الأسلاك الموجودة على الأقطاب الكهربائية في الحمام. قم بتشغيل لوحة الحصول على البيانات ومولد النبض ومحول القوة.

اضبط محول القوة على إعداد 5G وقم بتصفيره. افتح برنامج عرض مختبر مخصص يعرض البيانات ويحفظها من محول القوة. قم بإنشاء ملف نصي فارغ جديد في مجلد البيانات لكل عينة باستخدام ملاقط ، وقم بإزالة البنية من دعامة المندل عن طريق تحريك حلقة البناء برفق من دعامة التفلون ووضعها فوق العمود المعدني الثابت في نظام قياس القوة.

حمام متوسط. استخدم الملقط لدفع ورفع الهيكل حول عمود محول القوة. ضع الطرف الآخر من الهيكل فوق ذراع محول الطاقة وشدها حتى يقرأ محول الطاقة.

1.0 غرام قوة على محفز القلب. اضبط جهد النبضة على 20 فولت ، والمدة إلى ستة مللي ثانية ، والمعدل إلى هرتز واحد. ابدأ السرعة الكهربائية بالضغط على زر إيقاف تشغيل الإخراج.

ابدأ التسجيل حتى يصبح شكل الموجة منتظما. تحليل شكل الموجة في MATLAB لتحديد معدل قوة الانكماش ومعدل الاسترخاء. يغطي هيكل الفيبرين لخلايا عضلة القلب في البداية عرض القالب بالكامل.

بعد أسبوعين من الثقافة ، يتقلص إلى ما يقرب من خمس العرض الأولي. يولد الإيقاع الكهربائي للبناء بيانات قوة الارتعاش كما هو موضح هنا. من المتوقع أن تكون قوى نشل تبلغ حوالي 1.3 مللي نيوتن.

تعتمد صلاحية الخلية للبناء على مدى بعد الخلايا عن سطح البناء الملامس لوسط الثقافة بسبب قيود انتشار الأكسجين في البناء. على سطح البناء ، لوحظت جدوى عالية للخلية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. لوحظ الهيكل المحاذاة للبناء عن طريق تلطيخ سلسلة الميوسين الثقيلة باللون الأحمر Connexion 43 ، وهو أمر ضروري لاقتران الخلية بين الخلايا العضلية باللون الأخضر.

بمجرد إتقانها ، يجب أن يستغرق البروتوكول بأكمله حوالي خمس ساعات. سيستغرق جزء العزل الأول حوالي ثلاث ساعات. في حين أن جزء تصنيع البناء سيستغرق حوالي ساعتين أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم دائما إبقاء الإبرة متجهة لأسفل لمنع دمج فقاعات الهواء في شبكة الفيبرين.

علاوة على ذلك ، فإن إمالة القالب ستحافظ دائما على ثقب الإبرة في أعلى نقطة أثناء الحقن ، مما يضمن ملء صب القالب بالكامل بمحلول الفيبرين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تغليف خلايا عضلة القلب في هيدروجيل الفيبرين على شكل حلقة عن طريق عزل خلايا عضلة القلب أولا عن الفئران حديثي الولادة ، ثم حقن صب محلول الفيبرين في القوالب الأسطوانية التي يتم تجميعها بسهولة.