استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء زراعة مشتركة طويلة الأمد لنزلة نفلة الهيموفيلوس غير القابلة للتصنيف أو NTHI مع الأنسجة الظهارية التنفسية البشرية الأولية باستخدام نموذج مجرى الهواء epi. يتم تحقيق ذلك عن طريق تلقيح السطح القمي ب NTHI للسماح للبكتيريا بالالتصاق بالأنسجة ودخولها كخطوة ثانية. يتم غسل الحشوات كل 24 ساعة باستخدام DPBS الدافئ مسبقا لتقليد التدفق الطبيعي للمخاط وإزالة نفايات الميوسين وأي بقايا خلوية.

بعد ذلك ، يتم حصاد الأنسجة في النقطة الزمنية المطلوبة ويتم تحديد بقاء الخلية الكلية المرتبطة أو الداخلية. أخيرا ، باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تقييم الخصائص المحددة للسلالة لبقاء NTHI داخل الأنسجة بمرور الوقت بناء على عدد البكتيريا القابلة للحياة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للعدوى طويلة الأمد مع الهيموفيلوس النزلة الوافدة غير القابلة للتصنيف.

يمكن استخدامه أيضا في دراسة مسببات الأمراض البشرية الأخرى مثل Moraxella Alis مما يدل على أن هذا الإجراء سيكون الدكتور دوين زميلا لما بعد الدكتوراه في مختبري. قم بإزالة لوحة النقل من عبواتها واستعد لبدء التجربة. رش لوحة النقل بنسبة 70٪ من الإيثانول وضع اللوحة في خزانة السلامة الحيوية.

Aliquot ملليلتر واحد من أربع درجات مئوية ، والممرات الهوائية epi ، ووسائط الصيانة في كل بئر من ستة ألواح آبار. ثم بعد إزالة الشريط ، افتح اللوحة وقم بإزالة الشاش الذي يغطي إدخالات مجرى الهواء epi. باستخدام حركة ملتوية ، استخدم الملقط لتحرير ملحق من العروق.

ضع الملحق في أحد آبار لوحة الآبار الستة إذا لزم الأمر. استخدم قطعة قطن معقمة لإزالة الحمض بعناية من الملحق ، وتجنب لمس الغشاء. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة أسفل الحشوات.

ثم ضع لوحة الآبار الستة في حاضنة. اغسل الحشوات يوميا على النحو التالي ، وقم بتسخين DPBS بالكالسيوم والمغنيسيوم ، واملأ طرفا ب DPBS. ثم باستخدام ملقط معقم ، التقط ماصة برفق 200 ميكرولتر من DPBS الدافئ على الأنسجة.

ثم قم بهز الملحق لتوزيع DPBS بالتساوي دون لمس الأنسجة. بعد ذلك، قم بإمالة الملحق بزاوية وضع طرف ماصة P 1000 مقابل الحلقة البلاستيكية التي تحمل الغشاء في الجزء السفلي من الملحق. ثم استنشق المحلول العازل بعناية وضع المحلول في أنبوب التبريد لدراسته لاحقا.

أخيرا ، قم بشفط وسائط الصيانة القاعدية واستبدلها بملليلتر واحد من الوسائط الجديدة. قم بتسخين المزيد من DPBS بالكالسيوم والمغنيسيوم. أضف ثلاثة ملليلتر من DPBS الدافئ إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، ثم أعد تعليق مستعمرات مفردة من الأنفلونزا غير القابلة للكتابة أو NTHI المزروعة بين عشية وضحاها على أجار الشوكولاتة في الأنبوب.

الآن قم بتدوير الأنبوب بقوة لمدة 10 ثوان على الأقل ، ثم قم بقياس الكثافة البصرية. استمر في إضافة مستعمرات مفردة من NTHI حتى يصل تركيز البكتيريا إلى OD 600 نانومتر تقريبا 0.7. بعد ذلك ، اغسل كل ملحق مجرى هوائي EPI باستخدام DPBS الدافئ كما كان من قبل ، ثم أضف 28 ميكرولترا من التعليق البكتيري إلى السطح القمي لكل إدخال.

تجنب تلقيح وسائط الصيانة القاعدية. ثم أعد الطبق إلى الحاضنة لتحديد كمية NTHI أولا ، ثم أطباق أجار الشوكولاتة الجافة السطحية. بعد ذلك ، قم بتخفيف لقاح NTHI بشكل متسلسل باستخدام PBS معقم بنسبة 0.1٪ جيلاتين أو PBSG.

قم بإسقاط 10 ميكرولتر من اللقاح على الألواح ، ثم احتضن الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، حدد CFUs لكل مليلتر عن طريق حساب التخفيف الذي يحتوي على 15 إلى 30 مستعمرة مميزة في كل قطرة ، وحساب اللقاح الفعلي القابل للتطبيق من NTHI لحصاد إجمالي البكتيريا المرتبطة بالخلية. اشطف السطح القمي للممرات الهوائية الموسع ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من DPBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم.

ثم قم بإمالة الملحق وشطف أي وسائط صيانة متبقية من الغشاء القاعدي. ضع الملحق المغسول في طبق جديد من ستة آبار وأضف 250 ميكرولتر من محلول الصابونين المعقم بنسبة 1٪ على السطح القمي لكل نسيج. أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق أثناء احتضان اللوحة.

قم بإعداد أنابيب للتخفيف التسلسلي لملء كل أنبوب تخفيف ب 900 ميكرولتر من PBSG. بعد ذلك ، افرك الأنسجة من الغشاء بطرف ماصة P 1000 باستخدام حركة ذهابا وإيابا ، متبوعة بحركة دائرية لإزالة الأنسجة من حواف الملحق. ثم باستخدام طرف ماصة P 1000 كبير التجويف المعقم ، ضع التعليق في أنبوب إينور فارغ سعة 1.5 مل.

أضف الآن 250 ميكرولترا من DPBS على السطح القمي للإدخال ، ثم افحص الملحق باستخدام مجهر تباين الطور المقلوب لتحديد ما إذا كان هناك أي نسيج يجب حصاده. أضف التعليق إلى أنبوب einor وقم بتغطية 500 ميكرولتر من DPBS بقوة. دوامة تعليق الخلية لمدة دقيقة واحدة.

ثم باستخدام حقنة معقمة سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 26. استنشق التعليق في المحقنة من خلال الإبرة. مرر التعليق ببطء عبر الإبرة ثلاث مرات ، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات.

ثم دوامة التعليق بقوة لمدة دقيقة أخرى. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة كبير التجويف لنقل 100 ميكرولتر من التعليق إلى أنبوب التخفيف الأول. دوامة الأنبوب بقوة لمدة خمس ثوان ، ثم قم بعمل واحد إلى 10 لوحة إسقاط التخفيف التسلسلي على ألواح أجار الشوكولاتة.

ثم احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون للحصول على تعداد بكتيري قابل للحياة لحصاد البكتيريا الداخلية. اغسل كل ملحق ثلاث مرات فقط باستخدام 200 ميكرولتر من DPBS. استبدل وسائط الصيانة القاعدية بوسائط تحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر من كبريتات الجنتاميسين ، ثم أضف 300 ميكرولتر من وسائط الصيانة المحتوية على الجنتاميسين على السطح القمي.

أعد الإدخالات إلى الحاضنة لمدة ساعة واحدة أثناء احتضان الإدخالات مسبقا لتسخين بعض DPBS. ثم قم بإزالة وسائط الصيانة المحتوية على Gentamycin من السطح القمي. بعد ذلك ، اغسل السطح القمي والغشاء القاعدي للإدخالات على نطاق واسع باستخدام DPBS الدافئ.

أخيرا ، كرر إجراء التنظيف والحصاد الموضح للتو قبل إجراء التخفيفات التسلسلية والطلاء للبكتيريا الداخلية في هذا الشكل. مقارنة صور المجهر الإلكتروني الماسح لأنسجة مجرى الهواء الموسع غير المصابة على اليسار مع أنسجة مجرى الهواء الملوثة بفيروس التهاب الأنثوين الملوثة بخمسة أيام على اليمين. يمكن ملاحظة أن الزراعة المشتركة طويلة الأمد مع NTHI لا تؤدي إلى أضرار كبيرة للأنسجة القمية ، مما يؤكد فائدة نموذج مجرى الهواء epi.

هنا يتم عرض رسم بياني يصور عدد NTHI الذي تم استيعابه بمرور الوقت أثناء الزراعة المشتركة لمجرى الهواء epi. تم تلقيح سلالة R 2 8 6 6 في حوالي 10 من CFU السابع لكل إدراج. ثم تم حصاد البكتيريا الداخلية وتعداد البكتيريا في كل نقطة زمنية محددة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء ثقافة مشتركة طويلة الأمد ل NTHI مع أنسجة الجهاز التنفسي الهرمون الأساسي باستخدام نموذج A PRE.