تصور وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام السيتوكروم C أوكسيديز / سكسينات نازعة (كوكس / SDH) مزدوجة وضع العلامات الكيمياء النسيجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالتصور المباشر لنقص إنزيم الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في أقسام الأنسجة المجمدة الطازجة. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع أقسام ناظم التبريد أولا من الجهاز محل الاهتمام. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إجراء كيمياء كوكس هيستو ، والتي تتبعها كيمياء SDH Histo.

أخيرا ، يتم تجفيف أقسام الأنسجة وتركيبها وانزلاق الغطاء. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج مقدار الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا من خلال مقدار تلطيخ الخلايا الأزرق Hi.Today سنتحدث عن تقنية Cox SCH ذات العلامات المزدوجة للكيمياء النسيجية.

وعلى الرغم من أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة أمراض الميتوكوندريا ، إلا أنها يمكن أن توفر أيضا نظرة ثاقبة للشيخوخة والاضطرابات المرتبطة بالعمر. بعد إزالة الدماغ من تم التضحية به وفقا للتصريح الأخلاقي ، قم بتجميده بسرعة على الثلج الجاف. يمكن حفظ الأنسجة المجمدة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، ملفوفة بورق الألمنيوم حتى تصبح جاهزة للتقسيم.

جهز الأنسجة للاستئصال بالتبريد عن طريق وضع الدماغ على ظرف ناظم البرد وإحاطته بمركب التضمين. ضع الظرف بسرعة في ناظم البرد واجمع 14 قسما ميكرون عند 21 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإذابة الأقسام على الشرائح باستخدام كتلة تسخين ، ثم اترك الشرائح تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

ضع الشرائح في غرفة تلطيخ منزلقة بشرائط ورقية مبللة. نظرا لأن أوقات التفاعل مهمة في هذا الاختبار ، فمن المستحسن معالجة 10 شرائح كحد أقصى لكل تجربة تحت غطاء كيميائي. تحضير الحضانة ، الوسط الذي يحتوي على dab و cytochrome C في PBS و Vortex.

أضف بسرعة ميكروغرامين من CDEs البقرية إلى الوسط واخلطها جيدا عن طريق الدوامة. لتفتيت جميع حبيبات CDEs التي لا تزال تعمل تحت الغطاء، ضع 150 إلى 200 ميكرولتر من وسط الحضانة على كل شريحة باستخدام طرف الماصة لتنتشر بالتساوي على جميع الأقسام. احتضن الشرائح لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد 40 دقيقة ، قم بإزالة وسط الحضانة من الشرائح. اغسل الشرائح أربع مرات في PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد غسل الشرائح ، أعدها إلى غرفة تلطيخ الشرائح بشرائط ورقية مبللة تعمل تحت غطاء كيميائي.

قم بإعداد محلول NBT في PBS مع الحرص على حماية PMS من دوامة الضوء ، وقم بتطبيق 150 إلى 200 ميكرولتر من محلول NBT بسرعة على كل شريحة باستخدام طرف الماصة للانتشار بالتساوي على جميع الأقسام. احتضن الشرائح لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية بعد 40 دقيقة ، وقم بإزالة المحلول الزائد من الشرائح. اغسل الشرائح أربع مرات في PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة.

قم بتجفيف الشرائح لمدة دقيقتين لكل منهما بالتركيزات المتسلسلة التالية من الإيثانول. 70٪ 70٪ 95٪ 95٪ و 99.5٪ أخيرا ، اترك 10 دقائق في خطوة إضافية بنسبة 99.5٪. ضع الشرائح في الزيلين لمدة 10 دقائق مع LAN وقم بتطبيق زلات الغطاء.

اترك الشرائح تجف طوال الليل أو لمدة ساعة إلى ساعتين على الأقل في منطقة جيدة التهوية هنا. أقسام الدماغ من النوع البري والشيخوخة المبكرة. طن متري. تم تصنيف الفئران المتحولة في الحمض النووي بالتتابع لأنشطة COX و SDH.

يظهر نشاط كوكس الطبيعي المشار إليه من خلال تلطيخ اللون البني الداكن في الحصين للفئران البرية. تم الكشف عن أوجه القصور في كوكس التي أشار إليها التلوين الأزرق في الحصين من الفئران المتحولة MT DNA في 12 و 46 أسبوعا. كان هناك انخفاض آخر في نشاط كوكس بعمر 46 أسبوعا في الفئران المتحولة M-T-D-N-A مما يشير إلى تفاقم واسع النطاق لخلل السلسلة التنفسية.

أدت أوقات الحضانة غير الكافية لمدة 10 و 25 دقيقة إلى انخفاض ترسب منتج تفاعل الداب البني. سمحت أوقات الحضانة القصيرة بتكوين المنتج النهائي للأزرق Foran أثناء حضانة SDH مما يشير بشكل مضلل إلى وجود خلايا بها نقص في تغطية COX للانزلاق. أدت الشرائح أثناء حضانة COX أيضا إلى تكوين وترسيب غير دقيق لمنتج تفاعل DAB.

على الرغم من أنه يمكن تصنيف أنشطة Cox و SDH بشكل فردي كما هو موضح هنا ، فقد أثبتت الملصقات المتسلسلة أنها مفيدة في تحديد موقع الخلايا التي تعاني من خلل وظيفي في الميتوكوندريا. يظهر مثال على التحكم في الخصوصية لأنشطة COX و SDH في الدماغ من فأر من النوع البري وضع العلامات السلبية. لذلك لا تنس أن العمل مع المواد الكيميائية الموجودة في الملصقات المزدوجة Cox SCH هو البروتوكول الكيميائي خطير للغاية ويجب أن يتم الاحتياطات مثل ارتداء ملابس المختبر المناسبة والقناع الذي يعمل تحت الغطاء الكيميائي ، وكذلك التخلص من وسط الحضانة في كل مرة تقوم فيها بإجراء هذا الفحص.