A طريقة لوصفها الأوعية الدموية في الفئران الجنينية

يتمثل الهدف العام من التجربة التالية في تحديد آثار طفرات جينية محددة على تطور وبنية الأوعية الدموية. ويتحقق ذلك عن طريق تشريح الجنين والأنسجة خارج الجنينية معاً لتوفير عينة مناسبة للحقن. بعد ذلك، يتم حقن الوريد الوجهي بصبغة فلورية لوسم الأوعية الدموية السليمة.

بعد ذلك، يتم تحضير الجنين للتحليل. وفي الختام، تُستخدم تركيبات كاملة أو قطاعات من الأوعية الدموية المحددة لإظهار البنية ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية الطبيعية استناداً إلى المجهر الفلوري المناعي للتركيبات الكاملة أو قطاعات الأنسجة. لقد خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنت مهتماً بتحديد النقطة الزمنية النمائية التي تتصل فيها الأوعية الدموية الطرفية بالغدة الزعترية عبر عملية تكوين الأوعية.

للبدء، قم بتحضير FXI dextran أو GS L one I selectin B four في PBS في أنبوب إبندورف سعة 1.5 مل؛ أضف 100 µL من مخزون fast green PBS بتركيز 1.25 mM إلى FXI dextran، أو 180 µL إلى GS L one I selectin B four بحيث تصبح المحاليل زرقاء اللون بشكل واضح. بعد ذلك، قم بتدفئة الأنبوب حتى 37 °C.

قم بتشريح الأجنة في المراحل من E 14.5 إلى E 18.5 مع أكياس المح وكيس المح معاً، مع ترك سويقة Allen Toic سليمة. انقل الأجنة إلى طبق بتري جديد واغمرها في PBS في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بوضع الجنين للحصول على منظر سهمي للوجه.

بعد ذلك، باستخدام ملقط تشريح دقيق، أمسك الجنين برفق من منطقة الرأس. وباستخدام إبرة قياس 30 gauge، احقن 50 µL من FXI dextran أو GS L one I selectin B four في الوريد الوجهي، مع توجيه الإبرة نحو الجزء الخلفي من الرأس. وعندما تصبح الصبغة مرئية في الوريد السري، قم بإزالة الإبرة وفصل الجنين عن الـ lan.

تخزين تويك. اترك الجنين في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لضمان انتشار الصبغة في جميع أنحاء الجنين. بعد السماح للصبغة بالانتشار في جميع أنحاء الجنين، قم بإزالة عينات من الجلد من مناطق الأطراف والظهر والمعدة.

اغسل عينات الجلد في محلول PBS البارد وثبتها في محلول 4%paraldehyde PBS لمدة ساعتين. بعد ذلك، اغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام قوارير شفافة سعة أربعة ملليلتر تحتوي على 2 mL من محلول PBS البارد. ضع عينات الجلد على شرائح مجهرية وأضف 100 µL من وسط التثبيت وغطاء شريحة إلى كل شريحة.

اترك الشرائح لتجف في الظلام قبل التصوير؛ حيث يمكن إجراء عملية التصفية باستخدام BABB ثم التصوير المجهري البؤري اللاحق للحصول على صور عالية الدقة للأوعية الدموية الجلدية. ولتحضير الأنسجة للتقطيع بالتجميد، قم بالتجميد السريع للأجنة الكاملة في النيتروجين السائل. ضع مادة OCT على كتلة التقطيع ثم قم بتثبيت الجنين.

قم بتقطيع الأنسجة المجمدة إلى مقاطع بسمك 10 micron واجمعها على شرائح. قم بتثبيت المقاطع في الأسيتون لمدة تتراوح من خمس إلى 10 دقائق، ثم اغسلها ثلاث مرات في محلول TBS بارد في مصل Donkey بنسبة 10% في TBS داخل غرفة رطوبة. وفي درجة حرارة الغرفة، أضف 100 microliters من الجسم المضاد الأولي إلى كل مقطع.

في هذا المثال، نستخدم الجسم المضاد من الجرذ المضاد لـ CD 31 البشري لوسم الخلايا المبطنة للأوعية، والجسم المضاد من الماعز المضاد لـ P-D-G-F-R beta البشري لوسم الخلايا حول الأوعية، وذلك لضمان توزيع الأجسام المضادة بشكل متساوٍ عبر المقطع. قم بتغطية الشرائح بشرائح من غشاء البارافيلم المقطعة فرديًا. تُحضن الشرائح لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى ليلة كاملة في غرفة رطبة عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، يتم غسل المقاطع ثلاث مرات في محلول TBS بارد. تُحضن المقاطع مع 100 µL من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 30 دقيقة على الأقل. وأخيرًا، تُغسل ثلاث مرات في محلول TBS بارد، ثم يُضاف 100 µL من وسط التثبيت وشريحة غطاء إلى كل شريحة.

اترك الشرائح لتجف في الظلام. أما بالنسبة للتقطيع باستخدام جهاز الـ vibram، فقم بتشريح فصوص الغدة الزعترية من الأجنة واغسلها في PBS بارد. ثم قم بتثبيت النسيج في 4%paraldehyde PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

بعد غسل العينات في محلول PBS Triton X، املأ خرطوشة بلاستيكية صغيرة بنسبة 4% من agarose PBS منخفض الانصهار. اغمر العينات في محلول agarose PBS، مع التأكد من ملامسة النسيج لقاع الخرطوشة. اترك الـ agarose يتصلب على الثلج.

بعد ذلك، استخدم شفرة حلاقة لقص الزوائد من مادة agros. ضع الغراء على كتلة VIBRAM ثم قم بتثبيت العينة على الكتلة. صب محلول PBS البارد في حمام Vibram المائي حتى تغمر العينة والشفرة.

اضبط السرعة والسعة. يجب تقليل السعة. وإذا تكسرت المقاطع نتيجة للتحريك المفرط، فقم بقطع 50 مقطعاً من النسيج.

بعد ذلك، وباستخدام الملاقط، انقل المقاطع إلى محلول PBS البارد في صفيحة ميكروية ذات 24 بئراً، ثم قم بحجب المقاطع في 500 µL من مصل الحمير بتركيز 10% في محلول PBS Triton X لمدة 30 دقيقة؛ وبعد إضافة الأجسام المضادة الأولية مثل anti CD 31 و anti P-D-G-F-R beta، قم بالتحضين لمدة ثماني ساعات أو طوال الليل في صفيحة ميكروية مغطاة عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، اغسل المقاطع ثلاث مرات في محلول PBS Triton X على مدار ثماني ساعات إجمالاً عند درجة حرارة 4 °C.

بعد حجب المقاطع مرة أخرى والتحضين مع الأجسام المضادة الثانوية، اغسل العينات ثلاث مرات في PBS Triton X على مدار ثماني ساعات إجمالاً عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. ثم أعد تثبيت العينات في 4%paraldehyde PBS لمدة 30 دقيقة على الثلج واغسلها ثلاث مرات إضافية في PBS Triton X على مدار 30 دقيقة على الثلج. قم بتجفيف العينات من الماء من خلال سلسلة متدرجة من methanol PBS Triton X لمدة 10 دقائق في كل خطوة.

ثم استبدل الميثانول بتركيز 100% بميثانول جديد واتركه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ضع العينة على شريحة زجاجية مقعرة وغطِّ العينة بمحلول مكون من BABB والميثانول بنسبة واحد إلى واحد. اترك العينات لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة.

بعد ذلك، استبدل المحلول بـ 100%BABB واحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة أو حتى تصبح شفافة. أضف غطاءً زجاجياً وأغلقه بطبقتين إلى ثلاث طبقات من طلاء الأظافر. اترك طلاء الأظافر ليتصلب في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

يمكن تخزين العينة عند درجة حرارة 4 °C، ولكن يجب التقاط الصور خلال فترة تتراوح من 12 إلى 24 ساعة. يتم تصوير المقاطع المجمدة بسمك 10 micron باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) عبر عدسة plan A per chromat بقوة 20x وفتحة 0.8، مع استخدام خطوط الليزر 6 33 و4 88 و5 43 nanometer. يتم الحصول على مقاطع Z بؤرية بسمك 1 micron من مقاطع مثبتة في agarose بسمك 50 micron باستخدام عدسة plan A per chromat بقوة 10x وفتحة 0.4 مع خطوط الليزر 4 88 و5 43 و6 33 nanometer. يتم إعادة بناء مقاطع Z المتسلسلة باستخدام برنامج Zeiss AIA vision 4.6 أو برنامج تحليل الصور image analysis software. يعد الوسم الفعال للأوعية الدموية الجنينية أمراً بالغ الأهمية لتقييم عيوب الأوعية الدموية في أجنة الفئران. توضح هذه الأشكال وسماً محدداً للأوعية الدموية في الغدة الزعترية في المرحلة E 16.5، ووسماً مشتركاً لـ a GS L one I selectin.

ب أربعة أجنة محقونة بـ CD 31 بالإضافة إلى صبغ البطينين الأيمن والأيسر. تم استخدام بروتوكول GSL one I selectin B four للمقاطع المجمّدة في هذه التجارب. يظهر هنا وسم كامل لشبكة الأوعية الدموية الجلدية في فئران في المرحلة E 16.5 بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن استخدام طرق أخرى، مثل الوسم المشترك للخلايا السدوية وخلايا الدم مع الأوعية الدموية، للإجابة على أسئلة إضافية مثل: كيف تتفاعل خلايا الدم والخلايا السدوية مع الأوعية الدموية في جنين الفأر في كل من الظروف الطبيعية والمرضية؟