October 7th, 2011
هذه المقالة طريقة لوصفها الجلد والأوعية الدموية الجنينية الغدة الصعترية.
الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد تأثيرات طفرات جينية معينة على نمو الأوعية الدموية وبنيتها. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الجنين والأنسجة الجنينية الإضافية معا لتوفير عينة مناسبة للحقن. بعد ذلك ، يتم حقن وريد الوجه بصبغة فلورية لتسمية الأوعية الدموية السليمة.
ثم يتم تحضير الجنين للتحليل. أخيرا ، حوامل الثقب أو أقسام الأوعية الدموية المسماة صورة لإظهار الهيكل ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية الطبيعية بناء على الفحص المجهري المناعي للتألق لثقب الثقب أو أقسام الأنسجة. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنت مهتما بتحديد النقطة الزمنية التنموية التي يتصل بها الأوعية الدموية الطرفية بالغدة الصعترية عن طريق تكوين الأوعية.
للبدء في إعداد FXI dextran أو GS L واحد ، أختار B أربعة في PBS في أنبوب einor سعة 1.5 مليلتر ، أضف 100 ميكرولتر من المخزون ، 1.25 ملليمولار PBS أخضر سريع إلى FTSE dextrain ، أو 180 ميكرولتر إلى GS L واحد. أختار B four بحيث تكون الحلول زرقاء بشكل واضح. بعد ذلك ، قم بتسخين الأنبوب إلى 37 درجة مئوية.
قم بتشريح الأجنة E 14.5 إلى E 18.5 وأكياس الصفار معا ، تاركة ساق Allen Toic سليمة. انقل الأجنة إلى طبق بتري جديد واغمرها في PBS في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع الجنين للحصول على رؤية سهمية للوجه.
ثم باستخدام ملقط تشريح دقيق ، أمسك الجنين برفق في الرأس. باستخدام إبرة قياس 30 ، قم بحقن 50 ميكرولترا من FXI dextran أو GS L one ، أختار B أربعة في وريد الوجه ، مشيرا الإبرة نحو مؤخرة الرأس. عندما تكون الصبغة مرئية في الوريد السري ، قم بإزالة الإبرة وافصل الجنين عن الشبكة المحلية.
تويك ستور. اترك الجنين بالبقاء في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تنتشر الصبغة في جميع أنحاء الجنين. بعد السماح للصبغة بالدوران في جميع أنحاء الجنين ، قم بإزالة عينات الجلد من مناطق الأطراف والظهر والمعدة.
اغسل عينات الجلد في PBS البارد وثبتها في 4٪ بارالديهايد PBS لمدة ساعتين. ثم اغسلها ثلاث مرات لمدة 10 دقائق كل منها في قوارير شفافة بسعة أربعة ملليلتر مع ملليلترين من PBS البارد. ضع عينات الجلد على شرائح المجهر وأضف 100 ميكرولتر من وسط التثبيت وزلة غطاء لكل شريحة.
اترك الشرائح تجف في الظلام قبل مسح التصوير في BABB ويمكن إجراء التصوير متحد البؤر اللاحق للحصول على صور عالية الدقة لأوعية الجلد. لتحضير الأنسجة للاستئصال بالتبريد ، قم بتجميد الأجنة الكاملة في النيتروجين السائل للاستئصال بالتبريد. انشر OCT على كتلة قسم وقم بتركيب الجنين.
قطع الأنسجة المجمدة إلى أقسام بسمك 10 ميكرون وجمعها على شرائح. ثبت الأقسام في الأسيتون لمدة خمس إلى 10 دقائق ، ثم اغسلها ثلاث مرات في كتلة TBS الباردة في مصل الحمار 10٪ في TBS في غرفة الرطوبة. في درجة حرارة الغرفة ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي إلى كل قسم.
في هذا المثال ، نستخدم الفئران المضادة للولايات المتحدة CD 31 لتسمية البطانة والماعز المضادة للولايات المتحدة P-D-G-F-R beta لتسمية الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية لضمان انتشار الجسم المضاد بشكل موحد عبر القسم. قم بتغطية الشرائح بشرائط فيلم باريو مقطوعة بشكل فردي. احتضن الشرائح لمدة ساعة إلى ليلة واحدة في غرفة رطوبة عند أربع درجات مئوية.
بعد ذلك ، اغسل الأقسام ثلاث مرات في البرد. يحتضن TBS ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 30 دقيقة على الأقل. أخيرا ، اغسل ثلاث مرات في TBS البارد أضف 100 ميكرولتر من وسط التركيب وغطاء زجاجي لكل شريحة.
اترك الشرائح تجف في الظلام. لتقطيع الاهتزاز ، قم بتشريح فصوص الغدة الصعترية من الأجنة واشطفها في PBS البارد. ثبت الأنسجة في 4٪ بارالديهايد PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
بعد غسل العينات في PBS Triton X ، املأ خرطوشة بلاستيكية صغيرة بنسبة 4٪ من الذوبان المنخفض. يقوم PBS بغمر العينات في PBS المنشأ ، مع التأكد من أن الأنسجة على اتصال بالجزء السفلي من الخرطوشة. دع النشأة تتصلب على الجليد.
ثم استخدم شفرة حلاقة لقطع الكمية الزائدة. ضع الغراء على كتلة VIBRAM وألصق العينة بالكتلة. صب PBS البارد في حمام Vibram المائي حتى يتم غمر العينة والشفرة.
اضبط السرعة والسعة. يجب تقليل السعة. إذا تفككت الأقسام بسبب التحريض الزائد ، فقم بقطع 50 قسما من الأنسجة.
ثم باستخدام الملقط. انقل الأقسام إلى PBS بارد في صفيحة مجهرية 24 بئر ، قم بكتلة الأقسام في 500 ميكرولتر من مصل الحمار بنسبة 10٪ في PBS Triton X لمدة 30 دقيقة بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية مثل anti CD 31 و anti P-D-G-F-R beta تحتضن لمدة ثماني ساعات إلى بين عشية وضحاها في صفيحة دقيقة مغطاة بأربع درجات مئوية. اغسل بعد ذلك ثلاث مرات في PBS Triton X على مدار ثماني ساعات عند أربع درجات مئوية.
بعد سد الأقسام مرة أخرى واحتضان الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل العينات ثلاث مرات في PBS Triton X على مدار ثماني ساعات عند أربع درجات مئوية. ثم أعد إصلاح العينات في 4٪ بارالديهايد PBS لمدة 30 دقيقة على الثلج واغسلها ثلاث مرات أخرى في PBS Triton X على مدار 30 دقيقة على الجليد. قم بتجفيف العينات من خلال سلسلة الميثانول المتدرجة PBS Triton X لمدة 10 دقائق في كل خطوة.
ثم استبدل الميثانول بنسبة 100٪ بالميثانول الطازج واحتضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ضع العينة في شريحة منخفض زجاجية وقم بتغطية العينة بمحلول واحد لواحد من BABB والميثانول. احتضان العينات لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
بعد ذلك ، استبدل المحلول ب 100٪ BABB واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة أو حتى يتم تطهيره. أضف غطاء زجاجي وأغلقه بطبقتين إلى ثلاث طبقات من طلاء الأظافر. اسمح لطلاء الأظافر بالتصلب في ظلام درجة حرارة الغرفة.
يمكن تخزين العينة عند أربع درجات مئوية ، ولكن يجب عليك التقاط الصور في غضون 12 إلى 24 ساعة. صورة 10 ميكرون أقسام مجمدة بمجهر متحد البؤر باستخدام الخطة أ لكل كرومات 20 في 0.8 الهدف مع 6 33 4 88 و 5 خطوط ليزر 43 نانومتر تكتسب أقساما Z متحدة البؤر واحدة من 50 ميكرون أقساما مدمجة باستخدام الخطة A لكل كرومات 10 × 0.4 مع خطوط ليزر 4 88 5 43 و 6 33 نانومتر تعيد بناء أقسام Z التسلسلية باستخدام Zeiss AIA vision 4.6 أو بالأحرى تحليل الصور يعد وضع العلامات الفعالة على البرمجيات للأوعية الدموية الجنينية أمرا بالغ الأهمية لتقييم عيوب الأوعية الدموية في الفئران الجنينية. تظهر هذه الأرقام وضع علامات محددة للأوعية الدموية الغدة الصعترية E 16.5 ووضع العلامات المشتركة على GS L الذي أختاره.
ب أربعة حقن الجنين بقرص مضغوط 31 بالإضافة إلى تلطيخ البطينين الأيمن والأيسر. تم استخدام بروتوكول GSL one I selectin B four لأقسام التبريد في هذه التجارب. يظهر هنا وضع العلامات على الثقب لشبكة الأوعية الدموية الجلدية على الفئران E 16.5 باتباع هذا الإجراء.
يمكن استخدام طرق أخرى مثل وضع العلامات المشتركة للخلايا اللحمية وخلايا الدم مع الأوعية الدموية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيف تتفاعل خلايا الدم والخلايا اللحمية مع الأوعية الدموية في جنين الفأر في كل من الظروف الطبيعية والمرضية؟
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
تصف هذه المقالة طريقة لتسمية الأوعية الدموية للجلد والجنين في الجنين. تتضمن التقنية حقن صبغة فلورية في الوريد الوجهي لتصور الأوعية الدموية للتحليل.
Robust visualization of embryonic vasculature is critical for de-risking early-stage target validation in organogenesis and vascular biology. This method enables precise mapping of vascular networks and identification of developmental defects, supporting predictive confidence in genetic and pathway interrogation. Its ability to label vasculature across multiple embryonic tissues positions it as a reusable platform for discovery-stage phenotypic screening and mechanistic studies.
This vascular labeling method integrates into the discovery continuum from early genetic hypothesis testing through lead identification and preclinical model development.