Name: الجينوم على نطاق الشاشة لأهداف ميرنا باستخدام معرف الهدف المكتبة MISSION (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: تعلم كيفية إجراء فحص شامل للجينوم لأهداف الميكروRNA باستخدام مكتبة Target ID. تُستخدم هذه الطريقة لتحديد أهداف الجينات بدقة عالية من خلال خطوط خلوية مستقرة وتحليل التسلسل العميق.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الحياة سيجما كامل العلم بعثة الهدف رقم مكتبة فريق التطوير، خصوصا كيفن Gutshall من أجل العثور على التكنولوجيا والتفاوض على شروط الترخيص، وHolemon هيذر لتقديم الدعم لها والمشاركة في مناقشات مثمرة استكشاف الأخطاء وإصلاحها. كما نشكر الدكتور يوب Gäken من كينجز كوليدج بلندن لتبادل بحرية النتائج غير المنشورة والاقتراحات، وقاضي حامد RxBiosciences لتحضير وجبات كبيرة من [كدنا]، واصراره في الحصول على أنها مستنسخة. نود أن نعترف نان لين وبحر سكوت من SAFC لتنفيذ المصفوفات [كدنا] وتحليل البيانات. المهمة هي علامة تجارية مسجلة لشركة التكنولوجيا الحيوية سيغما الدريخ

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

الكتاب تعلن العلاقات المالية مع المؤسسات التجارية التي لديها مصلحة في العمل المقدم.

microRNAs هي 20-24 RNAs والنوكليوتيدات التي تنظم التعبير الجيني في مرحلة ما بعد transcriptionally التي تحول دون ترجمة مرنا، وبشكل متكرر، زعزعة استقرار مرنا المستهدفة (النظر في [6]). ويجوز للميرنا واحدة تنظم عدة مئات من mRNAs للسيطرة على استجابة الخلية لمؤشرات التنموية والبيئية. تحديد والتحقق من صحة mRNAs هدف أساسي في تحديد دور ميرنا وظيفة في هذه المسارات. ومع ذلك، وتحديد الهدف ليست مباشرة، لأنه في الحيوانات، miRNAs والمواقع المستهدفة ليست متكاملة تماما. في &quot;البذور&quot; المنطقة، والقواعد من 2 إلى 7 من نهاية 5&#39;-من ميرنا، عادة ما تكون مكملة لأهدافها. ومع ذلك، هناك العديد من الاستثناءات لقاعدة البذور، والمصب قاعدة الاقتران يمكن أن تعوض عن مباراة البذور ناقص. وقد تم وضع عدد من خوارزميات الكمبيوتر للتنبؤ اهداف ميرنا على أساس مطابقة البذور والتعويض المصب، والبنية الهدف 1د موقف، والحفاظ على تسلسل، وغيرها من المعالم المختلفة التي لوحظت للأهداف التحقق تجريبيا (مراجعة في [7]). بينما في silico التنبؤات هي مريحة وتفعل الكثير من تحديد أهداف ميرنا ساري المفعول، وتوقع معظم الجينات فشل التحقق من صحة الاختبارات التجريبية، وعدم توقع الكثير من الأهداف الفعلية. وعلاوة على ذلك، منذ وتستند خوارزميات الكمبيوتر في ملامح الهدف التي سبق تحديدها، أنها لا تسمح باكتشاف الأهداف التي تحيد عن ما هو معروف بالفعل. وقد تم استخدام عدد من النظم التجريبية بنجاح لتحديد أو اكتشاف الأهداف ميرنا وظيفية في الخلايا الحية. هذه الأساليب تشمل الفحص العالمية ميكروأرس الحمض النووي الريبي والتسلسل، RNA المشترك مناعي (RIP)، ومستقرة وصفها النظائر مع الأحماض الأمينية في ثقافة خلية (SILAC)، وهي طريقة البروتين (مراجعة في [7]). كل أسلوب له مزاياه وعيوبه. منذ ميرنا تستهدف زعزعة الاستقرار في كثير من الاحيان مرنا ويؤدي الى تدهورها، يا خسارةويمكن البحث في زيادة مستوى مرنا بعد إدخال ميرنا تقليد أو المانع، على التوالي، وتحديد الأهداف ميرنا. تم الكشف بسهولة هذه الخسارة أو الربح من مرنا من قبل ميكروأري أو تسلسل عميق. في حين طرق الكشف مرنا هي أبسط وأكثر حساسية من طرق الكشف البروتين، والكشف عن مرنا يغيب عن أي أهداف ميرنا التي ليست متدهورة. التقارير الأخيرة من مختبر Bartell مقارنة النتائج المستهدفة من الكشف عن الحمض النووي الريبي ميرنا مع هؤلاء من SILAC [8] أو التنميط الريبوسوم [9] إشارة إلى أن miRNAs الثدييات التصرف في الغالب عن طريق خفض مستويات مرنا الهدف. ومع ذلك، فقد اكتشفت مختبرات أخرى كثيرة تعمل مع الأهداف الفردية ميرنا تغير في البروتين ولكن أي تغيير في مستوى مرنا. تقارير ما يبدو أن تنظيم متعدية مع عدم فقدان مرنا للكشف ما يلي: مير 10B في HOXD10 [10]، miR221/222 على p27kip1 [11]، مير-21 على Pdcd4 [12]، مير 126 في p85β [13] مير-34 على SIRT1 [14]، مير-21 على PTEN [15]، مير 302d في Arid4b [16]، مير 200C على JAG1 [17]، 567 مير 299، 297، و، والثانية 609 في VEGFA [18]. وعلاوة على ذلك، كلانسي وآخرون [19] ذكرت مؤخرا ان تم الكشف عن تنظيم متعدية فقط بواسطة Let-7 عندما تم الكشف عن الأشكال الإسوية مرنا الفردية التي تحتوي على موقع دعونا-7 الهدف بشكل انتقائي. هذه الأخيرة تشير إلى أنه، على الأقل في بعض الحالات، يمكن التغاضي عن تنظيم متعدية في لمحة مركب - وهذا هو، عندما يتم الكشف عن جميع الأشكال الإسوية مرنا واحدة مرنا - التي تم الحصول عليها كما هو الحال مع العديد من ميكروأري والتحليلات تسلسل. وسوف يشارك في مناعي من ميرنا، مرنا المجمعات عبر argonaute (ago2 عادة) أو بروتين آخر يرتبط (الحمض النووي الريبي مناعي، أو RIP) عزل أهداف ميرنا بغض النظر عن آلية التنظيم. وبالإضافة إلى ذلك، RIP بالكشف عن الذاتية، ويفترض من الناحية البيولوجية ذات الصلة، وتفاعلات. ومع ذلك، وليس من المعروف ما إذا كانت جميع التفاعلات ميرنا، مرنا وظيفية، وRIP من شأنه أن يفوت أي أهداف مرنا أن أضم عابر فقط أو تتدهور بسرعة. وعلاوة على ذلك، لا بد من استنتاج محدد ميرنا-مرنا شركاء bioinformatiلأن ساتيا جميع أزواج ميرنا-مرنا شارك في عجل معا. أخيرا، SILAC يحدد مباشرة على المنتج النهائي للتنظيم ميرنا، وهو البروتين نفسه، ولكن غير حساس ويفتقد بالتالي البروتينات النادرة والتغييرات أضعاف صغيرة في مستويات البروتين. في ضوء القيود الحالية مع الأساليب ميرنا تحديد الهدف، وشعرنا بان من الضروري ايجاد فحص إضافي العالمي لتحديد أهداف ميرنا الفنية من خلال آلية بديلة. لتلبية هذه الحاجة، مرخصة لدينا التكنولوجيا التي اخترعها Gaken يوب والعظيم Mohamedali من كينجز كوليدج بلندن. اختراعهم هو التحام اختيار مزدوج البروتين، وعلى وجه التحديد، وكيناز-zeocin ثيميدين الانصهار، والتي تنظمها مكتبة [كدنا] من احتمال تسلسل الهدف ميرنا في 3&#39;UTR لها. ويمكن تحديد خلايا transfected ثابت مع والتعبير عن TKzeo، [كدنا] يبني مع zeocin، كما هو موضح في الشكل رقم 2. بعد تعبر عن ميرنا من مصلحة، يمكن تحديد الأهداف التي ميرنا ووايganciclovir عشر، كما هو موضح في الشكل رقم 3. Ganciclovir يقتل الخلايا معربا عن كيناز ثيميدين، وهذا هو، أي الخلايا معربا عن TKzeo، [كدنا] تفتقر هدفا لميرنا من الفائدة. ويمكن أن تكون معزولة استهدفت [كدنا] من التضخيم PCR من الحمض النووي من الخلايا التي البقاء على قيد الحياة باستخدام ganciclovir الاشعال التي يمكن أن تكون متسلسلة الجناح المنتجات [كدنا]، وPCR لتحديد الأهداف. لقد قمنا بتطوير تكنولوجيا كلية الملك إلى وسيلة جديدة لتحديد الهوية العالمية، واكتشاف أهداف وظيفية ميرنا الإنسان - معرف الهدف المكتبة البعثة. مع الهدف المكتبة الهوية، ويمكن للمستخدمين عزل أهداف ميرنا من خلال سلسلة من الثدييات خلية ترنسفكأيشن الثقافة وخطوات اختيار الدواء. مكتبة شاملة، ويحتوي على 66-79٪ من الجينات البشرية. النتائج الأولية تشير إلى أن كلا اكتشف سابقا، وكذلك يمكن أن تكون معزولة أهداف جديدة من معرف المكتبة بعثة الهدف. على الرغم من أن البروتوكول هو من بعض طول،استخدم هدف المكتبة رقم قياسي يتطلب تقنيات مختبر الجزيئية - زراعة الخلايا الثديية، ترنسفكأيشن، واختيار الدواء، PCR، والتسلسل - وبالتالي، ينبغي أن يكون جيدا في وسائل معظم علماء الأحياء. نقترح ان يتم إيلاء الاهتمام الكافي لتصميم التجارب المناسبة، وتحسين ظروف والثقافة، والأهم من ذلك، قبل اختبار كل نوع من الخلايا الجديدة لتحديد مستويات الدواء الأمثل للحصول على خطوات اختيار (قتل، منحنيات) لضمان نجاح مع الهدف المكتبة الهوية. كما هو الحال مع جميع وسائل ميرنا تحديد الهدف، ومن المستحسن جدا أن يتم التحقق من صحة الأهداف التي تم تحديدها عن طريق فحص مكتبة معرف الهدف مع الأسلوب الثاني، مثل [ميكروأري، qRT PCR، مراسل فحص (أي luciferase المراسل)، أو تحليل الغربية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> في Jumpstart REDTaq للخرسانة الجاهزة </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> بوروميسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> توبو TA </td><td> إينفيتروجن </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute الثدييات الجينوم الحمض النووي Miniprep كيت </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> ك خلية Nucleofection محددةهذا </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> إينفيتروجن </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> الهدف رقم المكتبة </td><td> سيغما الدريخ </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

الجينوم على نطاق الشاشة لأهداف ميرنا باستخدام معرف الهدف المكتبة mission

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

تم تصميم المكتبة الرقم المستهدف للمساعدة في اكتشاف وتحديد الأهداف من microRNA (ميرنا). مكتبة معرف الهدف هو البلازميد ومقرها الجينوم على نطاق مكتبة [كدنا] المستنسخة في اتجاه مجرى النهر 3&#39;UTR من انصهار بروتين ثنائي اختيار، ثيميدين كيناز-zeocin (TKzeo). الجولة الأولى من اختيار هو لtransformants مستقرة، تليها مع الأخذ ميرنا من الفائدة، وأخيرا، واختيار لcDNAs تحتوي على هدف وميرنا و. ويتم تحديد cDNAs مختارة من قبل التسلسل (انظر الشكل 1-3 لمعرف الهدف سير العمل المكتبات والمعلومات). لضمان تغطية واسعة من transcriptome الإنسان، تم إنشاؤها الهدف رقم مكتبة cDNAs عبر بنسبة ضئيلة من DT فتيلة باستخدام مجموعة من الحمض النووي الريبي مجموع المحضرة من أنسجة بشرية متعددة وخطوط الخلية. مما أدى مجموعة [كدنا] 0،5-4 كيلو بايت، مع متوسط ​​حجم 1.2 كيلوبايت، وكانت مستنسخة في البلازميد المزدوج اختيار p3TKzeo (انظر الشكل 4 لخريطة البلازميد). الأهداف الجينات ممثلة في لىويمكن الاطلاع على الموقع الشبكي لbrary سيغما الدريخ. نتائج من التسلسل البورشيد (الجدول 3)، وتبين أن المكتبة تضم 16922 من 21518 جينات فريدة من نوعها في RefGene UCSC (79٪)، أو 14000 الجينات مع 10 أو أكثر يقرأ (66٪).

مكتبة معرف الهدف هو البلازميد ومقرها الجينوم على نطاق جمع من [كدنا] المستنسخة يستخدم لتحديد أهداف ميرنا. هنا علينا أن نبرهن كيفية استخدامه وتطبيقه.

الجينوم على نطاق الشاشة لأهداف ميرنا باستخدام معرف الهدف المكتبة MISSION

صُممت مكتبة تحديد الأهداف (Target ID Library) للمساعدة في اكتشاف وتحديد أهداف الحمض الريبي النووي الميكروي (miRNA). وتعتبر مكتبة تحديد الأهداف عبارة عن نظام قائم على البلازميد، ...

الهدف العام من التجربة التالية هو إجراء فحص واسع النطاق وعالي الإنتاجية لأهداف micro RNA على مستوى الجينوم باستخدام مكتبة target ID. ويتم تحقيق ذلك من خلال ترانسفكشن الخلايا ببلازميد المكتبة. ويتبع ترانسفكشن مجموعة واسعة من CDNAs المستنسخة على مستوى الجينوم عملية اختيار لخطوط خلوية مستقرة.يتم بعد ذلك ترنسفكشن خلايا المكتبة المستقرة باستخدام بنية تعبير micro RNA للسماح بالتعبير المشترك لهدف micro RNA وثيميدين كيناز. وفي هذه المرحلة، يُستخدم الجانسيكلوفير لاختيار الخلايا التي تعبر عن أهداف micro RNA محددة عن طريق الاختيار ضد تعبير ثيميدين كيناز. ثم يتم تضخيم الـ CD NA الذي يحتوي على مواقع استهداف micro RNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات تضخيم معرف الهدف، وذلك من أجل تسلسل وتحديد أهداف مكتبة micro RNA.في النهاية، يتم الحصول على نتائج تحدد أهداف micro RNA محددة في الخلايا بناءً على تحليل التسلسل العميق. وقد صُممت مكتبة معرفات أهداف المهمة للمساعدة في اكتشاف وتحديد الأهداف الجينية لـ micro RNA. ونقوم هنا بتوضيح كيفية استخدامها وتطبيقها.قبل البدء في هذا البروتوكول، اختر خطاً خلوياً لا يعبر عن IRA المستهدف أو يعبر عنه بمستويات منخفضة، ثم قم باستزراع الخلايا وتوسيعها للحصول على ما يقرب من 2 × 10⁷ خلية عند درجة تلاقي تصل إلى 80%. بعد المعالجة بالتربسين، انقل الخلايا إلى أنبوب معقم بسدادة لولبية سعة 15 مل، ثم قم بترسيب الخلايا المعالجة بالتربسين عند 200 ×g لمدة خمس دقائق. بعد إزالة الوسط، قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا المترسبة للغسل، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى وكرر عملية الغسل للمرة الثانية.وفي هذه الأثناء، قم بتجهيز عدد كافٍ من أنابيب سعة 0.5 milliliter بما يتناسب مع عدد عمليات عفن الخلايا (transfection)، وذلك بإضافة 2 µg من مكتبة ID المستهدفة إلى كل أنبوب. والآن، قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا الموجودة داخل أنبوب سعة 15 milliliter باستخدام 600 µL من محلول maxim Nucle affection لكل عملية عفن خلايا. يتم ذلك بتفاعل واحد في كل مرة.أضف 100 µL من الخلايا إلى الجزء المقسم، و 2 µg من البلازميد مع الخلط باستخدام طرف الماصة. انقل كل خليط إلى وعاء تأثير نووي. أدخل وعاءً واحدًا في جهاز التأثير النووي وشغّل برنامجًا مُحسَّنًا ومناسبًا لسلالة الخلايا.بعد ذلك، املأ ماصة نقل بوسط زراعي مُدفأ مسبقاً. اسحب الخلايا التي تم نقل الجينات إليها باستخدام الماصة نفسها وانقلها إلى بئر واحد في طبق ستة آبار تم تحضيره مسبقاً. كرر هذه العملية لكل NU nuclear affection تتبع NU nuclear affection.أعد الخلايا إلى غرفة النمو للتحضين طوال الليل حتى اليوم التالي. استبدل الوسط الغذائي واترك الخلايا لتتعافى لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام. وبمجرد تعافي الخلايا، قم بإزالة الوسط الغذائي وأضف وسطاً كاملاً يحتوي على المستوى المناسب من eosin للاصطفاء من أجل التكامل المستقر والتعبير عن بروتين TKZO الاندماجي.يمكن تحديد تركيز الإيوزين مسبقاً كما هو موضح في النص. تابع الخلايا لعملية اختيار الإيوزين من خلال مراقبة حيوية الخلايا. استبدل الوسط بوسط جديد يحتوي على الإيوزين كل يومين إلى ثلاثة أيام.بمجرد وصول الخلايا إلى مرحلة التلاقي في الطبق ذي الستة آبار، يتم نقل مجموعة الخلايا وتوسيعها في دوارق أكبر. يُجرى تحليل منحنى القتل (kill curve) لتحديد الجرعة المميتة الدنيا لكواشف الانتقاء المستخدمة في الدراسة. ولتجنب الاستجابات المظهرية غير المرغوب فيها عند إجراء منحنيات القتل، يتم أولاً توزيع الخلايا في كل بئر من طبق ذي 96 بئراً يحتوي على 120 microliters من الوسط الغذائي الطازج في اليوم التالي.أضف الدواء إلى الآبار المحددة. تُستخدم المضادات الحيوية G four 18 أو pure mycin للاختيار لصالح دمج بنية تعبير mirna، أو يُستخدم acyclovir للاختيار ضد تعبير thymidine kinase. خلال فترة الحضن، افحص حيوية الخلايا لكل تركيز من الدواء كل يومين، مع استبدال الوسط الذي يحتوي على كاشف الاختيار كل ثلاثة أيام.يجب استخدام الحد الأدنى من تركيز كاشف الاختيار الذي يسبب موت الخلايا بشكل كامل بعد الوقت المطلوب لهذا النوع من الخلايا والتجربة، وذلك بعد تحديد تركيزات الدواء. قم بالتحضير لعملية ترانسفكشن (transfection) لـ MI عن طريق تنمية وتوسيع خلايا مكتبة ID المستهدفة للوصول إلى 2 × 10⁷ خلية. استخدم التريبسين (Trypsin) عندما تتجاوز درجة تلاقي الخلايا (confluency) 80%.انقل الخلايا إلى أنبوب معقم بسعة 15 milliliter ذي غطاء لولبي وقم بترسيبها عند 200 ×g لمدة خمس دقائق. أزل الوسط واغسل كتلة الخلايا المترسبة مرتين كما سبق. بعد ذلك، لكل عملية ترانسفكشن، أضف 2 µg من بلازميد تعبير MIRA إلى أنبوب سعة 0.5 milliliter.قم بإجراء عملية النقل النووي (NU nuclear affection) لـ mRNA إلى خلايا المكتبة باستخدام نفس الطريقة المستخدمة في ترانسفكشن مكتبة الـ ID المستهدفة. بعد تعافي الخلايا لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام، استبدل الوسط بوسط كامل يحتوي على المستوى المناسب من المضاد الحيوي، وفقاً لما تم تحديده من اختبار منحنى القتل (kill curve test).راقب الخلايا لاختيار المضادات الحيوية، مع استبدال الوسط بوسط يحتوي على المضاد الحيوي كل يومين إلى ثلاثة أيام. وبمجرد وصول الخلايا إلى مرحلة الالتحام في طبق الستة آبار، قم بنقل المجمع وتوسيع الخلايا في دوارق أكبر. وكما سبق، استبدل الوسط بوسط طازج يحتوي على المستويات المناسبة من GCV والمضاد الحيوي.راقب الخلايا للتحقق من تعبير thymidine kinase وتعبير mRNA من خلال حيوية الخلايا، وقم بتكثير الخلايا الناجية في وجود GCV والمضاد الحيوي. بعد ذلك، قم بتحضير DNA جينومي من الخلايا التي تم اختيارها بواسطة GCV. قم بتضخيم غرسات المكتبة المختارة باستخدام PCR بواسطة بادئات الطقم، ثم قم باستنساخها فرعيًا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.يمكن بعد ذلك إجراء تفاعلات التسلسل باستخدام بادئات التضخيم. وكخطوة نهائية، يتم تحديد الأهداف الجينية عن طريق محاذاة blast للتسلسلات مع النسخ النسخي البشري (transcriptome) للنسخ المعروفة، ومع الجينوم البشري للنسخ الجديدة. تم نقل بنية تعبيرية لـ mere 3 73 بشكل مستقر إلى مكتبة MC seven واختيارها في وسط يحتوي على ganciclovir لإثراء الخلايا التي تعبر عن أهداف mere 3 73.ليس لـ GCV أي تأثير على خلايا MCF seven بدون المكتبة لأنها لا تعبر عن الثيميدين كيناز. ومن ناحية أخرى، تعبر خلايا مكتبة C seven عن الثيميدين كيناز، ولكن لا يتم القضاء عليها تمامًا بواسطة ganciclovir عند تركيز 8 أو 16 micromolar، كما يتضح من امتصاص الخلايا الحية لصبغة brilliant blue. ومع ذلك، فإن خلايا المكتبة تتوقف عن النمو في GCV، كما يتضح من لون صبغة phenol red في الوسط الخاص بها.لا تقوم الخلايا المتوقفة عن النمو بتحميض الوسط الخاص بها، وبالتالي يظل اللون مائلاً للحمرة. وبدلاً من التغير إلى اللون البرتقالي، تم عزل تتابعات مستهدفة صفراء من الخلايا الناجية، ثم جرى تضخيمها بواسطة PCR وتسلسلها.تم الحصول على ما يقرب من 12 مليون قراءة cDNA تم تعيينها لما يقرب من 12,000 جين فريد. ومن بين هذه الجينات الفريدة، اعتُبر 234 جينًا بمثابة نتائج موثوقة بناءً على تكرار الظهور، وكانت خاصة بـ mere 3 73. وأظهرت مقارنة أولية أن 10 من الجينات الفريدة التي تم تحديدها باستخدام مكتبة target ID موجودة أيضًا في قائمة أهداف mere 3 73 المحددة مسبقًا في tar base.وبناءً على ذلك، فمن المرجح أن تكون هذه الأهداف العشرة أهدافاً صالحة لـ mere 3 73، ويجري حالياً توصيفها للتحقق من صحة النتائج المختارة تجريبياً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مكتبة معرفات أهداف المهمة لإجراء فحص عالي الإنتاجية على نطاق الجينوم لتحديد أهداف جينات micro RNA.

genome-wide-screen-for-mirna-targets-using-mission-target-id

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هنا نستخدم مكتبة esiRNA الإنسان في شاشة عالية الإنتاجية للجينات لها دور في انقسام الخلايا. نحن لشرح كيفية إعداد وإجراء شاشات esiRNA ، فضلا عن كيفية تحليل والتحقق من صحة النتائج.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

هنا نستخدم مكتبة LentiPlex الإنسان المجمعة التقليدية وأساليب التسلسل الجيني لتحديد أهداف تعزيز بقاء الخلية. نحن لشرح كيفية إعداد وdeconvolute شاشة LentiPlex والتحقق من صحة النتائج.

LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

MicroRNAs (miRNAs) هي منظمات هامة في التعبير الجيني ، وثبت أنها تلعب دورا في العديد من العمليات البيولوجية. إلى فهم أفضل لميرنا ، UTR التفاعلات ، وقد انشأنا مجموعة واسعة من الجينوم للصحفيين UTR 3 luciferase يقترن جينة luciferase الرواية وكاشف مقايسة ، ونظام LightSwitch.

تحديد الأهداف من microRNAs الإنسان مع نظام الفحص LightSwitch Luciferase به مراسل 3&#39;UTR - a يبني وmicroRNA مقلد في خلايا منتسب

التحديد المضيء للعناصر الوظيفية في 3' مناطق غير مترجمة (3'UTRs) (3'LIFE) هي تقنية لتحديد التنظيم الوظيفي في 3'UTRs بواسطة miRNAs أو عوامل تنظيمية أخرى. يستخدم هذا البروتوكول منهجية عالية الإنتاجية مثل تعداء 96 بئرا ومقايسات لوسيفيراز لفحص مئات التفاعلات المفترضة للقمع الوظيفي.

الكشف عن أهداف ميرنا في إنتاجية عالية باستخدام الفحص 3&#39;LIFE

يعد تحديد أهداف الأدوية الجديدة التي تنتقل من الاختبارات قبل السريرية إلى التجارب البشرية أولوية علمية. تحقيقا لهذه الغاية ، نصف هنا نهج الجينوم الوظيفي لفحص تأثير استنفاد الجينات على كرويات خط الخلايا السرطانية ، والتي تصمم بشكل أكثر ملاءمة السرطانات البشرية في الجسم الحي.

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

ويصف هذا التقرير طريقة سريعة وموثوق بها للتحقق من صحة الأهداف مرناً من ميرناس الخلوية. يستخدم أسلوب يحاكي ميرنا بيوتينيلاتيد الاصطناعية على أساس تأمين LNA "الحمض النووي" لالتقاط الهدف مرناً. بعد ذلك، تستخدم المغلفة streptavidin الخرز المغناطيسي المنسدلة الهدف مرناً للقياس الكمي ب qPCR تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الاعتداء على أساس البيوتين المنسدلة للتحقق من صحة مرناً ميرناس "الأهداف الخلوية"

وصف هنا هو بروتوكول لتوصيف وحدات miRNAs التازر بيولوجيا وتجميعها في الجينات القصيرة ، والذي يسمح التعبير الفوقي في وقت واحد لتطبيقات العلاج الجيني.

توصيف miRNAs المرتبطة وظيفيا في الورم الصفراوي وهندستها إلى مجموعات اصطناعية للعلاج الجيني

هنا ، نقدم خط أنابيب miRNA جديدا ومؤتمتا بالكامل ، mirMachine يمكنه 1) تحديد miRNAs المعروفة والجديدة بشكل أكثر دقة و 2) مؤتمت بالكامل ومتاح مجانا. يمكن للمستخدمين الآن تنفيذ برنامج نصي قصير للإرسال لتشغيل خط أنابيب mirMachine المؤتمت بالكامل.

mirMachine: متجر شامل لشرح miRNA للنبات

يصف هذا البروتوكول سير عمل التحرير الجيني للتحرير الجيني للتكرار الباليندرومي القصير (CRISPR) عالي الإنتاجية المتجمع بانتظام لتحليل شبكة مجموعة microRNA التي تسمح بالتوليد السريع للوحة من خطوط الخلايا المعدلة وراثيا التي تحمل مجموعات فريدة من نوعها لحذف أعضاء مجموعة miRNA بحجم 35 كيلو بايت في تجربة واحدة.

أداة تحرير الجينات كريسبر لتحليل الشبكة العنقودية MicroRNA

لقد طورنا نهجا مقارنا لعلم الأورام الجيني عبر الأنواع باستخدام التحليلات الجينومية والشاشات الجينومية الوظيفية لتحديد ومقارنة الأهداف العلاجية في الأورام الناشئة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا ونوع الورم البشري المقابل.

التنميط الجيني وفحص التسرب على نطاق الجينوم لتحديد الأهداف العلاجية في نماذج الفئران لورم غمد العصب المحيطي الخبيث

يصف البروتوكول مقايسة تهجين التألق المناعي الترادفي مع الأنسجة المضمنة بالبارافين المثبت بالفورمالين لاكتشاف وقياس الحمض النووي الريبي الصغير والبروتينات متعددة الإرسال في وقت واحد.

تضخيم الحمض النووي الريبي الصغير والتعرف عليه من خلال التهجين الموضعي الموضعي كطريقة جديدة للكشف والقياس الكمي

تعلم كيفية إجراء فحص شامل للجينوم لأهداف الميكروRNA باستخدام مكتبة Target ID. تُستخدم هذه الطريقة لتحديد أهداف الجينات بدقة عالية من خلال خطوط خلوية مستقرة وتحليل التسلسل العميق.

الجينوم على نطاق الشاشة لأهداف ميرنا باستخدام معرف الهدف المكتبة MISSION

استكشف المزيد من الفيديوهات