Name: الجينوم التحرير مع مخصص Nucleases CompoZr فنجر الزنك (ZFNs) (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: اكتشف تحرير الجينوم باستخدام نوكليازات أصابع الزنك المخصصة CompoZr لإنشاء خطوط خلوية مُعطلة. تتيح هذه الطريقة للباحثين إجراء تعديلات جينية دقيقة ومتوقعة دون الحاجة إلى الاختيار.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. عرف عملية ZFN التصميم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للإسراع في عملية تصميم ZFN، وينبغي أن محقق توفر ما يلي: </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معلومات عن الجينات المستهدفة مثل اسم الجينات والأنواع والجينات، وعدد الشرح / تحديد الهوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبوضوح أكثر من كل شيء الهدف من التجربة (على سبيل المثال، الضربة القاضية أو Knockin) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أي من العوامل المحددة للهدف الجينات التي تشمل شاذة بنية الجينات والبيولوجيا خاص المتورطين في مكان وراثية، أو أي مناطق متماثلة في مكان آخر في الجينوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نطاق معين من تسلسل الحمض النووي لالاصبع الزنك nucleases لاستهداف. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فريق المعلوماتية الحيوية سيغما تجري في تصميم ZFN السيليكو الأولية لتطوير المواقع المستهدفة الزنك الاصبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتقدم الأولية المواقع المستهدفة ZFN إلى مستشار ZFN التقنية والعلمية. لمشاريع أكثر تعقيدا من الناحية الفنية، هذا عالم سيغما يعمل مع المحققين لوضع استراتيجية المشروع. </li><l zfn><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعلوماتية الحيوية ويوفر هدف ZFN أعلى المواقع إلى محقق للمراجعة. بناء على موافقة من المواقع ZFN هدفا محتملا، وتقدم هذه المعلومات إلى فريق الإنتاج ZFN للبدء في عملية تصنيع ZFN. </li></l></ol> 2. عرف ZFN الإنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستخدم الأرشيف سيجما من وحدات الاصبع الزنك لتجميع التصاميم ZFN المعتمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجميع كل تصميم ZFN وتسلسل التحقق من على منصة عالية الإنتاجية الاستنساخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إرسالها مرة واحدة انتاج جميع التصميمات ZFN يتم استكمال كل ZFN إلى التحقق من الصحة. </li></ol> 3. التحقق من ZFNs مخصص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاريع في ZFNيتم التحقق من صحة الإنسان، والجرذان والفئران أو CHO الأنواع في خطوط الخلايا تتميز أيضا لكل نوع، يتم استخدام فحص خميرة القائم للكائنات الحية الأخرى أو أنواع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تسليم البنى ZFN في خط الخلية المناسبة من قبل nucleofection وأعرب ZFNs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حصاد الحمض النووي من تجمع لخلايا ZFN transfected والمنطقة من الفائدة هو تضخيم PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويجري بعد ذلك فحص-1 سل على المنتج PCR. يتم تشغيل هلام إستشراد على فحص-1 سيل إلى نشاط ZFN التحقق من صحتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتقدم بعد ذلك ZFN أعلى نشاط تصميم كما أكده فحص سيل-1 إلى العميل. يتم تسليم ZFNs في مرنا والحمض النووي البلازميد مع بادئات PCR لفحص الجوف (1) والحمض النووي الجيني كعنصر تحكم إيجابية. </li></ol> 4. تسليم ZFNs المصادق عليها من قبل Nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 2x10 5 خلية / مل في اليوم السابق nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم nucleofection،اخراج الخلية الخط Nucleofector كيت الخامس وترك الحارة إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ملحق للNucleofection الخامس الحل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا. يجب أن تكون كثافة الخلايا بين الخلايا 5 2.5-5x10 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل لوحة 6 جيدا مع 2ml من المتوسط ​​في كل جيدا، وقبل الدافئة في حاضنة CO 2 في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 20 دقيقة قبل nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة 2x10 6 خلايا في ترنسفكأيشن (8X10 6 المجموع) في 200xg لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 20 مل من محلول هانك في سولت المتوازن (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنابيب التجريبية: (انظر الجدول في النشرة الفنية مخصص ZFN) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة 6 جيدا تحتوي على وسائل الإعلام من الخطوة (6.5) من الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 400 ميكروليتر (100 ميكروليتر / رد فعل) من الحل Nucleofection V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد فعل واحد في وقت واحد، أضف 100 ميكروليتر من الخلايا إلى كل DNA أو الرنا التي تحتوي على أنبوب. Transfإيه هذا المزيج على كوفيت مم electroporation 2 و nucleofect على Nucleofector مع البرنامج المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد nucleofection من كل عينة، واستخدام ماصة نقل لإضافة ~ 500 ميكرولتر من متوسط ​​prewarmed من لوحة 6 جيدا في الخطوة (6.9) إلى كوفيت. ثم، بعناية نقل الخلايا من كفيت والمتوسطة في prewarmed المتبقية في لوحة 6 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتهاء من كل ردود الفعل والعودة لوحة 6 جيدا للحاضنة CO 2 في 37 درجة مئوية. </li></ol> 5. حصاد الحمض النووي الجينوم بعد التسليم من ZFNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 كذلك لوحة - لا حصاد كافة الخلايا المجمعة. من المهم للحفاظ على الثقافة من أجل الحصول على الخلايا وحيدة الخلية إلى استنساخ تخفيف بعد التأكد من أن لديك منتجات سيل-1 الهضم. واحد إلى ثلاثة أيام بعد nucleofection جمع الخلايا لإعداد الحمض النووي الصبغي باستخدام الحمض النووي الجيني GenElute الثدييات Miniprep كيت. </li></ol> 6. CEL-1 الفحص <li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR تضخيم الحمض النووي الجيني من العينات transfected ZFN والجينومية مراقبة إيجابية الحمض النووي المنصوص عليها في عدة، وذلك باستخدام بادئات الموردة. تم تعيين رد فعل PCR مع الشروط التالية: (انظر الجدول في النشرة الفنية مخصص ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد heteroduplexes من homoduplexes PCR تستغرق 10 ميكرولتر من رد فعل PCR من كل عينة ZFN المعالجة بالاضافة الى مراقبة واستخدام البرنامج التالي على thermocycler: 95 درجة مئوية، 10 دقائق 95 درجة مئوية إلى 85 درجة مئوية، -2 درجة مئوية / 2 85 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية، -0،1 درجة مئوية / 2 4 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من محسن و 1 ميكرولتر من S Nuclease (من رقم الكتالوج Transgenomic 706025) على كل رد فعل واحتضانها في 42 درجة مئوية لمدة 20-40 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الهضم على جل الصفحات TBE 10٪ مع علامات السليم، مثل الحمض النووي سلم DirectLoad WideRange (رقم الكتالوج D7058) (انظر النتائج في نشرة مخصصة التقنية ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيتم الكشف عن CE إشارة إيجابية في ZFN المعاملة من قبل السكان CEL-I فحص، والمضي قدما إلى العزلة نسيلي والتوصيف. </li> 7. نسيلي عزل وتوصيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وحيدة الخلية استنساخ نماذج ZFN المعالجة بالطرق العادية بما في ذلك نظام مراقبة الأصول الميدانية والاستنساخ التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للاستنساخ لتوسيع بما فيه الكفاية، ثم انشق بعض نسبة من الخلايا لحصاد الحمض النووي الجيني، وتجميد ما تبقى كما ظهر هذه المواد المخزونة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الحمض النووي الجيني من الحيوانات المستنسخة باستخدام بادئات الجوف أنا وتحليل amplicon بواسطة سيل-I فحص (مع وبدون الحمض النووي WT ارتفعت في)، أو بدلا من استخدام هذه amplicon إلى الانتقال مباشرة إلى التنميط الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ مرشح الوراثي التي تم تحديدها على أنها الأليلات قديم الأسلوب المفضل. </li></ol> 8. ممثل النتائج ويقدم مثالا على سير العمل كله ZFN CompoZr في الشكل 2. يتم تسليم ZFNsإلى الخلايا حيث ربط ويلتصق تسلسل الحمض النووي المناسبة مما يؤدي إلى كسر مزدوج الجديلة (DSB). عملية الإصلاح الطبيعية، وغير المتجانسة انهاء انضمام (NHEJ)، وإصلاح جهاز تسوية المنازعات. في بعض الحالات نتائج NHEJ الشاذة في الإدراج أو الحذف أو الاستبدال من النيوكليوتيدات. PCR التضخيم من حصاد نتائج الحمض النووي الجيني في تشكيل مضاعف متغاير بين نوع البرية وamplicons تعديل بعد تمسخ / خطوة الصلب للتفاعل PCR. علاوة على ذلك من نتائج انزيم سيل-1 في شق من أي جزيئات مضاعف متغاير. يتم حل CEL-1 النتائج وفقا لتحليل PAGE لتأكيد الانقسام ZFN. الشكل (3) يوفر التخطيطي لفحص الجوف (1) والنتائج المتوقعة. وترد ممثل سيل-1 النتائج في الأرقام 4 و 5 الشكل 4 يحتوي على النتائج من زوج نشطة جدا من ZFNs (21٪) في K562 الخلايا؛. الشكل (5) يحتوي على النتائج من زوج أقل نشاطا (2.4٪) من ZFNs فيK562 الخلايا. ويؤكد ZFN النشاط في كل من الأرقام عن وجود شظايا PCR 2 أدناه جزء PCR الوالدين. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. صممت تمثيل متجهة nucleases إصبع الزنك. ZFNs البروتينات تتألف من إصبع الزنك الحمض النووي ملزم نطاق تنصهر فيها إلى المجال انشقاق في نوكلياز داخلية تقييد FokI. عندما ملزمة باعتبارها مثنوي مغاير، ZFNs إنشاء فاصل المزدوج تقطعت بهم السبل في تسلسل الحمض النووي المستخدم المحدد. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. التخطيطي لسير عمل مخصص خدمة ZFN. التمثيل البياني لسير العمل لإنشاء خط خلية المعدلة وراثيا باستخدام ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل (3)"> الشكل 3. التخطيطي لفحص الجوف (1) والنتائج. A) ZFN س البلازميد يتم تسليم ص مرنا للخلايا. ب) أعربت عن ZFNs ربط وقطع تسلسلها الهدف خلق فاصل مزدوج الجديلة (DSB) في جزء من الخلايا. C) إصلاح الشاذة من بعض DSBs بواسطة مثلي عدم انهاء انضمام النتائج في النوكليوتيدات الإدراج أو الحذف. D) يتم حصاد الحمض النووي الجيني من تجمع transfected من الخلايا وتضخيمها في موضع الاهتمام. EF) PCR المنتج هو التشويه والتحريف وإعادة تشكيل مطوع خلق مضاعف متغاير بين نوع البرية وamplicons تعديل. ز) عدم تطابق نتائج فحص نوكلياز داخلية سيل-1 في شق من الجزيئات مضاعف متغاير. يتم حل H) سل-1 إنزيم يساعد على هضم بواسطة PAGE. الملاحظ أن نسبة من الناتج الانقسام إلى فرقة بالحقن، التي تحددها البرمجيات يماغيج، يدل على قطع جزء وكفاءة ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="الشكل 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4. CEL-1 النتائج من ZFNs نشط 21٪ يماغيج البرنامج متاح في:_blank "&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="الشكل 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 5"> الشكل 5. CEL-1 النتائج من 2.4٪ ZFNs نشط يماغيج البرنامج متاح على العنوان التالي:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

<ol><li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li>
<li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022(2010).</li>
<li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433(2009).</li>
<li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li>
<li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li>
<li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li>
</ol>

يمكن للباحثين تقديم ZFN خلايا معدلة أو الحيوانات للمتعاونين في إطار اتفاق للبحوث الترخيص القياسية. في هذا الظرف سيغما يطلب أن يتم وضع اتفاق لنقل المواد في مكان ما بين سيجما، والعملاء والمتعاونين ZFN بهم. ويمكن الاطلاع على الترخيص بحث في: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . إذا كان هناك إمكانية لتطبيق التجارية باستخدام الخلايا المعدلة ZFN سيجما ثم يطلب أن يتم وضع رخصة تجارية في المكان. وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المادة من قبل سيغما، وشركة

يتم عزل مرة ZFN المعدلة الخلايا لديهم دائم وراثية التعديلات الحمض النووي. هذه النتائج في القدرة على توليد خطوط الخلايا المعدلة ثابت أو الحيوانات تولد مع بعض التعديلات الوراثية المطلوبة لإجراء البحوث. CompoZr ZFNs مخصص توفير وسيلة قوية لجينوم التحرير في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. نشر الخريطة الجينية الناجحة مع تحرير ZFNs يشمل لكن لا يقتصر على خطوط الخلايا البشرية، الفأر، الجرذ، الزرد، الضفادع، الخنازير ونماذج البحوث CHO. 3،4،5،6،7،8،9 والقدرة على خلق وأكد المزدوج تقطعت بهم السبل انقطاع في موقع الهدف المنشود في نوع من الخلايا المحددة عندما يتم تسليمها بشكل صحيح ZFNs في خلية. ومن الممكن أيضا لأداء تسلسلي التعديلات إصبع الزنك إلى خلية من أجل أن يكون أكثر من التعديل الوراثي داخل الخلية. (10) القدرة على تحديد تسلسل هدف محدد وتعديلها فقط أن مكان معين هو السبب الرئيسي للقدرة على إنشاء عدة modifiالكاتيونات. يتم إنشاء شهادة CompoZr ZFN مخصص للتحليل مع الكواشف جدا المنصوص عليها في عدة وبذلك يضمن أنه تم جميع مكونات عدة التحقق من صحة تماما للنجاح العملاء. وتعرض الخطوات الحاسمة في سير العمل من البداية الى النهاية أدناه: استنساخ الخلية وينبغي اختبار القدرة على عزل وتوسيع خط خلية معينة قبل البدء في أي تجارب ZFN. ينبغي عزل الخلايا وحيدة وتوسيعها لضمان أن سكان clonally المستمدة من الممكن. بعض خطوط الخلايا هي المتمردة في هذه المسألة، والحيل مثل تخصيب اليورانيوم لاستنساخ التعديل، أو الثقافة مع وسائل الاعلام في ظروف يمكن أن تساعد في التغلب على هذه التحديات. تسليم كفاءة الاستغلال الأمثل للكفاءة تسليم أمر لا بد منه قبل تسليم ZFNs. ويمكن استخدام العديد من الأساليب بما في ذلك الدهون مقرها ترنسفكأيشن، electroporation، وnucleofectiفي. طريقة التسليم المثالي يتكون من احد ان يعطي مزيج معظم الأمثل للكفاءة تسليم وبقاء الخلية. قد Quantitating هذه الكفاءات أن يقدر من خلال تقديم سيطرة GFP البلازميد وquantitating بالمعاينة البصرية أو نظام مراقبة الأصول الميدانية 24 48hrs بعد التسليم. CEL-I مقايسة لا بد من أن يتم تنفيذ سيل-I فحص بالتوازي مع الضوابط المناسبة لضمان PCR، والهضم، والكهربائي المعلمات لن تتدخل في تفسير التجربة ZFN. كل مجموعة تضم الحمض النووي تحكم الجيني التي يتم استخدامها لخلق صورة سيل-I في شهادة التحليل. والتضخيم من الحمض النووي السيطرة مع الاشعال المقدمة تليها الجوف أنا الفحص تسمح للمستخدم لمقارنة النتائج مع تلك المنصوص عليها في شهادة التحليل (CofA) صورة، وعزل أي أوجه القصور المحتملة في هذا الجانب من تجربة. تعامل عنصر تحكم المناسبة السلبية مثل وهمية، أو خلية GFPوينبغي أيضا أن تدرج عينة للسماح للتوضيح أي من منتجات الانقسام غير محددة. نوعي / التحليل الكمي وحيدة الخلية المستنسخة بعد العلاج ZFN واحد استنساخ الخلية، قد يتم فحص السكان من الخلايا للتحرير في موضع الاهتمام من جانب عدد من الطرق. ويمكن إجراء CEL-I فحص الحمض النووي في الجينوم من الحيوانات المستنسخة لغرض تحديد استنساخ مرشح لمزيد من التنميط الجيني. من المهم أن amplicon ارتفاع PCR WT في amplicons عينة بنسبة 1:1 قبل تنفيذ سيل-I هضم مثل الحيوانات المستنسخة طافرة متماثل سوف تحتوي على جزيئات متجانسة، وبالتالي نقل سلبي سيل-I فحص النتيجة. طريقة بديلة لفحص هذه الحيوانات المستنسخة مرشح هو تصميم واحد هبوط التمهيدي PCR مباشرة على موقع الهدف ZFN. تستخدم جنبا إلى جنب مع واحدة من الاشعال السيطرة، نتيجة الفحص سلبية تشير إلى فقدان تسلسل WT. وهناك نسخة متخالف التي تحتوي على واحد على الأقل الأليل WT ذويمكن فصل درع PCR إشارة، ولكن من الحيوانات المستنسخة WT تماما قبل تنفيذ PCR في سياق qPCR SYBR. مرة واحدة وقد تم تحديد مرشح استنساخ بواسطة الطرق المذكورة أعلاه، قد تكون مرمزة من قبل pyrosequencing القياسية، وتسلسل عميق، أو تسلسل أساليب أخرى. لجميع طرق التسلسل، ينبغي إنشاء amplicon إنشاؤها من الحمض النووي الجيني نسيلي. ويمكن فصل لالأليلات pyrosequencing التقليدية بواسطة TA-PCR الاستنساخ المنتج، والتسلسل المستعمرات الفردية. لأساليب مثل التسلسل عميق هذه الخطوة ليست ضرورية. إصلاح تناظر إخراج (تقرير) يتيح هذا البروتوكول طريقة للخروج المغلوب ZFN بوساطة الجينات عبر NHEJ. ويمكن أيضا دمج الجينات المحورة سيجريه مقدمة من إحدى الجهات المانحة البلازميد مع الأسلحة التي تناظر الجناح موقع قطع ZFN. 11 في هذا السيناريو، ZFN خلقت يتم إصلاح المزدوج تقطعت بهم السبل انقطاع بواسطة HDR بدلا من NHEJ. توجه تقرير التنمية البشرية الأولويمكن تأكيد ntegration من الجينات المحورة باستخدام أساليب مماثلة للإجراءات المنصوص عليها في جميع أنحاء هذا البروتوكول. استكشاف الأخطاء وإصلاحها تسليم ZFNs ويمكن السيطرة على تسليم ZFN والتعبير التسليم عن طريق التسليم من GFP أو غيرها. هذا البلازميد و / أو التصور تحديد الكميات ويمكن التغلب على التعبير منخفضة نظرا لعدم توافق المروج مع نوع من الخلايا في المصالح عن طريق التسليم من ZFNs في شكل مرنا. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم استخدام أسلوب الصدمة الباردة لزيادة فعالية ZFNs في الخلايا. 12 إذا تم استخدام مرنا لا بد من أن تغسل الخلايا قبل التسليم لضمان أن يتم نقل جميع Rnases المصل المشتقة. بل هو أيضا من الحكمة أن ذوبان الجليد ومرنا على الجليد، وإضافة إلى هذه الخلايا في آخر لحظة جدا للحد من أي فرصة للتحلل. CEL-I مقايسة تأسيس آسا سيل-Iy هو التضخيم محددة وافرة من موضع الاهتمام. إذا لاحظت منتجات التضخيم غير محددة استخدام معيار PCR إجراءات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لزيادة خصوصية مثل الاستفادة المثلى من كمية القالب، وتركيز التمهيدي، وركوب الدراجات المعلمات. لتحليل PAGE في مقابل الكهربائي الاغاروز معيار كأسلوب الأخير لا يوفر القرار الملائم وحساسية. ويمكن أيضا CEL-I ظروف هضم يكون الأمثل في حال ملاحظة أي منتج هضمها أو تلطيخ المفرطة. ويمكن معاير معايرة كمية سيل-1 / وnuclease أو طول الفترة الزمنية الهضم لتحسين هذه الجوانب.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> Nuclease S (CEL-1 إنزيم) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> توسيع الدقة العالية PCR النظام </td><td> روش </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> خلية الخط Nucleofector كيت الخامس </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP سم داخلي المنشأ خالية البلازميد Maxiprep كيت </td><td> سيغما الدريخ </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

الجينوم التحرير مع مخصص nucleases compozr فنجر الزنك (zfns)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

الجينوم التحرير هي تقنية قوية التي يمكن استخدامها لتوضيح وظيفة الجين والأساس الجيني للمرض. الجينات التقليدية أساليب تحرير مثل المواد الكيميائية القائمة على الطفرات أو التكامل عشوائية من تسلسل الحمض النووي تمنح التغييرات الجينية العشوائية بأسلوب غير فعال الشاملة وتتطلب إدراج تسلسل الاصطناعية غير مرغوب فيه أو استخدام الظروف الشاذة ثقافة، يحتمل أن تكون مربكة دراسة بيولوجية. على النقيض من ذلك، يمكن للعابر التعبير ZFN في زنزانة تسهيل دقيق، الموروثة التحرير الجين بطريقة ذات كفاءة عالية دون الحاجة لإدارة المواد الكيميائية أو التكامل من الجينات المحورة الاصطناعية. nucleases إصبع الزنك (ZFNs) هي الانزيمات التي تربط وقطع متواليات متميزة من المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA). وظيفي من وحدة ZFN CompoZr يتكون من البروتينات 2 أحادى الفردية التي تربط الحمض النووي &quot;نصف موقع&quot; ما يقرب من 15-18 النيوكليوتيدات (انظر الشكل 1). عندما اثنين ZFN أحاديةالسائدة &quot;الوطن&quot; على مواقعهم الهدف المتاخمة المجالات الحمض النووي انشقاق dimerize وإنشاء فاصل مزدوج الجديلة (DSB) في الحمض النووي. 1 مقدمة من ZFN بوساطة DSBs في الجينوم يضع أساسا للتحرير الجينوم كفاءة عالية. يمكن إصلاح ناقص من DSBs في خلية عن طريق المنظمات غير المتجانسة في نهاية الانضمام (NHEJ) والحمض النووي مسار الإصلاح يؤدي إلى الإدراج الصغيرة والحذف (indels). ويمكن إنشاء indels ضمن تسلسل الجينات ترميز خلية يؤدي إلى انزياح الإطار، وبالضربة القاضية الفنية لاحق من مكان الجين على كفاءة عالية. 2 في حين أن هذا البروتوكول يصف استخدام ZFNs لخلق بالضربة القاضية جين، والتكامل من الجينات المحورة ويمكن أيضا أن تتم عن طريق تناظر الموجهة إصلاح في موقع قطع ZFN. مخصص CompoZr ZFN الخدمة يمثل نهج منتظم وشامل، وكذلك تتميز إلى تحرير الجينات المستهدفة للأوساط العلمية مع التكنولوجيا ZFN. العلماء سيجما العمل بشكل وثيق مع المحققين إلى 1) perfoRM تحليل العناية الواجبة بما في ذلك تحليل بنية الجينات ذات الصلة، والبيولوجيا، ونظام نموذجي وفقا لأهداف المشروع، 2) تطبيق هذه المعرفة لوضع استراتيجية سليمة تستهدف، 3) ثم تصميم وبناء، والتحقق من صحة وظيفيا ZFNs عن النشاط في ذات الصلة خط خلوي. المحقق يتلقى إيجابي الحمض النووي الجيني السيطرة والاشعال، والجاهزة للاستخدام الكواشف ZFN توفيره في كل من الحمض النووي البلازميد في المختبر وتنسيق مرنا المحولة. قد ثم يتم تسليم هذه الكواشف للتعبير عابر في خط خلية المحقق أو نوع من الخلايا في الاختيار. ثم يتم اختبار عينات لتحرير الجين في موضع الاهتمام من جانب معيار تقنيات البيولوجيا الجزيئية بما في ذلك التضخيم PCR، هضم الأنزيمية، والكهربائي. بعد يتم الكشف عن إشارة إيجابية لتحرير الجين في عدد السكان الأولية، الخلايا وحيدة الخلية المستنسخة ومرمزة لتحديد من الحيوانات المستنسخة طافرة / الأليلات.

مخصص CompoZr الزنك فنجر Nuclease (ZFN) خدمة تمكن دقيق التحرير الجينوم في أي كائن حي أو خط خلية في أي مكان محدد من قبل المستخدم. توضح هذه المقالة عملية لتصميم والتحقق من صحة وتصنيع وتنفيذ الخدمة CompoZr ZFN مخصص.

الجينوم التحرير مع مخصص Nucleases CompoZr فنجر الزنك (ZFNs)

يُعد تحرير الجينوم تقنية قوية يمكن استخدامها لتوضيح وظيفة الجينات والأساس الجيني للأمراض. أما طرق تحرير الجينات التقليدية مثل...

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام نوكلييز إصبع الزنك (ZFN) المصمم هندسياً لإحداث طفرة تعطيلية في موقع محدد، وذلك لإنشاء خط خلوي مستأصل الجينات في نهاية المطاف. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحليل تسلسل DNA للجين المستهدف باستخدام خوارزمية composer لإنشاء تصميمات ZFN من نوع insco. ثم يتم تجميع ZFNs ونقلها إلى الخلايا عن طريق التعداء النووي (NU nuclear affection)، وفحص نشاطها في مواقع الجينات المستهدفة الخاصة بها لإنشاء خط خلوي مستأصل الجينات.يتم أولاً معالجة نوع الخلايا المستهدف بـ ZFN نشط. ثم يتم فصل هذه المجموعة إلى خلايا مفردة. وأخيراً، يتم توسيع هذه المجموعات النسيلية لإجراء المزيد من التوصيف الجيني. ويمكن دراسة المستنسخات التي تحتوي على أحداث ربط غير متجانسة ومعطلة في الموقع المستهدف بشكل أكبر في سياق التعطيل الوظيفي للجين.وفي نهاية المطاف، يعد التوصيف الجيني، بما في ذلك مقايسة الخلية الواحدة وتسلسل DNA، ضرورياً لتأكيد التغيرات الملحوظة في النمط الظاهري الخلوي الناتجة عن التعديل الجيني بوساطة ZFN. وتكمن الميزة الرئيسية لـ zinc finger nucleuses مقارنة بالطرق الحالية مثل إعادة الاندماج المتماثل التقليدية في أن ZFN المكوّن يتيح تحريراً جينياً يسمح للباحثين بإجراء تعديلات جينية محددة وقابلة للتنبؤ دون الحاجة إلى عملية اختيار.يشمل ذلك تعطيل الجينات، وتعديلات الجينات، ودمج الجينات. تبدأ عملية تصميم نوكليازات إصبع الزنك (ZFN) بدراسات معلوماتية حيوية مبسطة، تركز على تحديد مناطق فريدة من التسلسل تحتوي على عدد وجودة كافية من أنماط ارتباط إصبع الزنك التي تساعد في تنفيذ عملية تعطيل الجينات. ومن شأن وجود استراتيجية تجريبية محددة بوضوح أن يسهل هذه العملية بشكل كبير، وكذلك المعلومات المتعلقة بالجين المستهدف، مثل بنية الجين غير النمطية، والبيولوجيا الخاصة المرتبطة بالموقع الجيني، وأي مناطق متجانسة في أماكن أخرى من الجينوم.بالنسبة للمشاريع الأكثر تعقيداً، سيعمل عالم من sigma بشكل وثيق مع الباحثين. يتم تصميم Z fns حاسوبياً (in silico) مع التنبؤ بمواقع الاستهداف غير المقصودة في كامل الجينوم. كما يتم إجراء تحليل لتكرار القناع (masking) وتحليل snip لكل موقع استهداف محتمل لـ ZFN.تتم مراجعة أفضل مواقع استهداف ZFN قبل البدء في إنتاجها. وغالباً ما يتساءل الباحثون: هل ستعمل ZFN في مشروعي؟ وللإجابة على هذا السؤال بشكل أفضل، يجب أن نأخذ في الاعتبار عدة اعتبارات رئيسية.هل يمكنك توصيل كاسيت تعبير نموذجي بكفاءة والتعبير عنه في نوع الخلايا المستهدف؟ وهل يمكنك عزل مستنسخات خلوية مفردة ومن ثم توسيعها؟ وأخيرًا، هل هناك تأثير ضار على نمو الخلايا أو حيويتها نتيجة تعطيل الجين المستهدف؟قد تحدد الإجابات على هذه الأسئلة مدى جدوى المشروع بدقة أو قد لا تفعل ذلك. ومع ذلك، فإنها تسمح لنا بتقييم مدى سهولة أو صعوبة مشروع معين، أو قد تسلط الضوء على جوانب محددة من سير العمل والتي تعد حاسمة للنجاح. تستخدم شركة Sigma أرشيفها من وحدات أصابع الزنك لتجميع تصميمات ZFN المعتمدة.يتم تجميع كل تصميم لـ ZFN والتحقق من تسلسله باستخدام منصة استنساخ عالية الإنتاجية. بعد ذلك، يتم تسليم ZF NS في شكل DNA بلازميدي إلى الخط الخلوي ذو الخصائص المحددة بدقة، حيث يتم التعبير عنها بشكل كافٍ خلال 24 إلى 48 ساعة. ثم يتم استخلاص DNA الجينومي من كل مجموعة من الخلايا المعالجة بـ ZFN، يليه تضخيم موقع استهداف ZFN بواسطة PCR.يتم إجراء مقايسة الخلية الواحدة (cell one assay) على نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ويتم تقييم أنشطة نوكليازات إصبع الزنك (ZFN) عن طريق الفصل الكهربائي للهلام. يتم تسليم تصميم ZFN الذي أظهر أعلى نشاط. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير حمض نووي جينومي كعينة ضابطة موجبة، إلى جانب بادئات PCR لإعادة إنتاج النتائج الموضحة في شهادة التحليل.لبدء تجربة ZFN، ابدأ باستزراع الخلايا بكثافة 200, 000 خلية لكل مليلتر في اليوم السابق لعملية النقل النووي (nu nuclear affection). وفي اليوم التالي، قم بعدّ الخلايا؛ وإذا كانت كثافتها تتراوح بين 250 و500, 000 خلية لكل مليلتر، فقم بتحضير محلول النقل النووي (NU nuclear affection solution V) الخاص بخط الخلايا الذي تعمل معه وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.الآن، املأ طبقاً مكوناً من ست فجوات بـ 2 mL من الوسط لكل فجوة، وقم بتدفئة الطبق في الحاضنة لمدة 20 دقيقة على الأقل. قم بطرد مركزي لـ 2 مليون خلية لكل عملية تثقيب نووي. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا برفق في 10 mL من HBSS. بعد ذلك، كرر إجراء الغسيل مرة أو مرتين إضافيتين. إن ZF NS التي يتم تقديمها بتنسيق mRNA عادةً ما تعطي ترددات تحرير جيني أعلى من تلك التي يتم تقديمها بتنسيق DNA البلازميدي.ومع ذلك، فإن إيصال ZF NS بتنسيق mRNA يتطلب اتخاذ بعض الاحتياطات الإضافية لتجنب التحلل. أولاً، اغسل الخلايا بحجمين إلى ثلاثة أحجام كبيرة من PBS أو HBSS لإزالة RNAs المشتقة من المصل. كذلك، يجب الحفاظ دائماً على mRNA على الثلج طوال فترة التجربة.وأخيراً، تأكد من إضافة mRNA إلى الخلايا في آخر لحظة ممكنة لتجنب التحلل. بعد ذلك، قم بتجهيز أنابيب التجربة وفقاً للجدول الموجود في النشرة الفنية الخاصة بـ ZFN. وبالنسبة لكل عملية عفن خلوي (transfection)، أعد تعليق الخلايا في 100 µL من محلول nuclear affection solution V، مع تحضير تفاعل واحد في كل مرة.أضف 100 µL من الخلايا إلى كل أنبوب يحتوي على DNA أو mRNA. ثم انقل كل خليط إلى جهاز التثقيب الكهربائي بمقاس 2 ملم. قم بمعالجة الخلايا باستخدام البرنامج المناسب فور الانتهاء من عملية التثقيب الكهربائي لكل عينة.استخدم ماصة نقل لإضافة نصف ملليلتر واحد من الوسط الدافئ من بئر في الطبق سداسي الجدران المُجهز. انقل الخلايا بعناية من qve مرة أخرى إلى الوسط المتبقي. أكمل جميع التفاعلات في ذلك البئر، ثم أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة تتراوح من يوم واحد إلى ثلاثة أيام.بعد عملية النوكليوفيكشن (nucleofection)، يتم عزل DNA الجينومي باستخدام مجموعة استخلاص DNA الجينومي الثديي المصغرة (genal loop mammalian genomic DNA mini prep kit) دون الحاجة إلى حصاد جميع الخلايا المجمعة. بعد ذلك، تُستخدم البادئات المرفقة لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم DNA الجينومي من العينات التي تم تحويلها بواسطة ZFN ومن DNA الجينومي الخاص بالضابط الموجب الموفر في المجموعة.قم بهضم كل ناتج PCR باستخدام واحد ميكرولتر (1 µL) من المعزز وواحد ميكرولتر (1 µL) من النوكلييز s. حضن العينات عند درجة حرارة 42 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 40 دقيقة. بعد ذلك، قم بإجراء عملية الفصل الكهربائي للنواتج المهضومة على هلام TBE بتركيز 10% مع استخدام مؤشرات مناسبة مثل direct load wide range DNA ladder، وذلك بعد استنساخ الخلايا المفردة للعينات المعالجة بـ ZFN والسماح للمستنسخات بالتوسع بشكل كافٍ.قم بحصاد جزء من الخلايا لاستخلاص الحمض النووي الجينومي (genomic DNA)، وواصل زراعة الخلايا المتبقية أو قم بتجميدها كمواد مخزنة. قم بتضخيم الحمض النووي الجينومي باستخدام بادئات cell one، ثم حلل الناتج عن طريق مقايسة cell one مع إضافة قطعة تضخيم من النوع البري (wild type amplicon) وبدون إضافتها بنسبة واحد إلى واحد. بدلاً من ذلك، استخدم قطعة التضخيم هذه للانتقال مباشرة إلى تحديد النمط الجيني للمستنسخات المرشحة عن طريق التسلسل أو أي طرق مفضلة أخرى.في هذا المثال، تم استخدام مقايسة الخلية الواحدة لتقدير نشاط زوج من خلايا ZF NS و K 5 62. يمثل المسار glan الضابط الموجب، بينما يظهر المسار Z نواتج القطع التي يتم من خلالها تقدير تكرار قطع PCR غير المتطابقة من هذه البيانات، وقد بلغ تقدير نشاط ZF N نسبة 21% وهي نسبة عالية جداً. نوضح هنا نشاط زوج مختلف من Z fns.كان زوج ZFN هذا أقل نشاطًا بشكل ملحوظ من الزوج الآخر، ولكنه ظل فعالاً. ويُقدر أنه تسبب في تكوين طفرات حذف أو إضافة (indels) في 2.4% من تعداد الخلايا. وتتضمن بعض المعايير الأكثر أهمية عند العمل مع ZF X تحسين عملية التوصيل والتعبير في نوع الخلايا المستخدم.من خلال تحسين هذه المعلمات، يمكن تقليل مقدار الوقت والجهد المطلوب لعزل الجين المعطل بشكل كبير. تمثل Clone Z fns أداة دقيقة للغاية لتحرير الجينوم المستهدف عند استخدامها بشكل صحيح وفي السياق المناسب. ويمكنها تزويد العلماء بوسيلة سريعة وفعالة لدراسة البيولوجيا في أي منتج جيني أو مسار تقريباً.

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو تقنية تحرير الجينوم القائم على نوكلياز إصبع الزنك في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs). نظرا لأنه يمكن تمييز hPSCs إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، فإن هذه التقنية مفيدة للدراسات المرضية والدوائية في المختبر بطريقة خاصة بالمريض.

تحرير الجينوم القائم على نوكلياز إصبع الزنك: تقنية لتعديل الجينوم في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عن طريق آلية إصلاح التماثل المعتمد على التماثل المزدوج

nucleases مصمم مثل nucleases إصبع الزنك (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs) يمكن استخدامها لتعديل جينوم الفأر الأجنة سابق للانغراس عن طريق إحداث كلا نهاية امتماثلان الانضمام (NHEJ) وإعادة التركيب مثلي (HR) مسارات. هذه التطورات تمكين جيل من الفئران السريع مع التعديلات الجينية دقيقة.

الماوس الجينوم الهندسية عن طريق Nucleases مصمم

خطوط الخلايا مراسل توفر وسيلة لتصور، وتتبع وعزل الخلايا من الاهتمام من السكان غير متجانسة. ومع ذلك، باستخدام إعادة التركيب مثلي التقليدية في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية استهداف الجين غير فعال للغاية. هنا، نحن تصف استهداف CNS محدد المخ الأوسط عامل النسخ PITX3 موضع مع EGFP باستخدام إصبع الزنك نوكلياز تعزيز إعادة التركيب مثلي.

الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

يمكن إجراء  تحرير الجينوم للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بسرعة وكفاءة. يتم تقديم إجراء تجريبي قوي للهندسة الوراثية لمركبات السلاسيوم العليا كما يتضح من تحرير موضع الملاذ الآمن AAVS1 للتعبير عن EGFP وإدخال مقاومة المضادات الحيوية.

إنشاء الجينوم تحريره المحفزة الإنسان خطوط الخلايا الجذعية: من استهداف لعزل

تحرير الجينوم المستهدفة في النظام النموذجي دانيو rerio (الزرد) إلى حد كبير مما يسر بظهور النهج المستندة إلى كريسبر. هنا، نحن وصف بروتوكول مبسطة وقوية لتوليد وتحديد الآليلات هراء المستمدة من كريسبر يتضمن المقايسة التنقل هيتيرودوبليكس وتحديد الطفرات باستخدام تسلسل الجيل القادم.

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

الهدف من هذا البروتوكول هو تمكين تحرير CRISPR/Cas9 السلس لجينوم C. elegans باستخدام مجمعات ريبونوكليوبروتين المجمعة وعلامة dpy-10 المشتركة CRISPR للفحص. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء مجموعة متنوعة من التعديلات الجينية في C. elegans بما في ذلك عمليات الإدراج والحذف واستبدال الجينات واستبدال الكودون.

CRISPR/Cas9 تحرير الجين C. elegans rbm-3.2 باستخدام علامة فحص dpy-10 Co-CRISPR ومجمعات ريبونوكليوبروتين المجمعة.

يصف هذا البروتوكول نهجا لتسهيل التعديلات الدقيقة في أجنة الزرد باستخدام تقنية CRISPR-Cas9. يتم تقديم خط أنابيب التنميط الظاهري لإثبات قابلية تطبيق هذه التقنيات لنمذجة متغير جيني مرتبط بمتلازمة فترة QT الطويلة.

تعديلات دقيقة بوساطة CRISPR-Cas9 في قلوب الزرد

أحدثت تقنيات كريسبر-كاس ثورة في مجال تحرير الجينوم. ومع ذلك ، فإن العثور على تعديل الخط الجرثومي المطلوب وعزله لا يزال يمثل عنق الزجاجة الرئيسي. لذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة قوية لفحص الحيوانات المنوية لأسماك الزرد المحقونة ب F0 CRISPR بسرعة لإجراء تعديلات على الخط الجرثومي باستخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية وهضم التقييد والرحلان الكهربائي الهلامي.

فحص الحيوانات المنوية للعزل السريع لتعديلات الخط الجرثومي في الزرد

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحرير فعال لقاعدة الأدينين دون قيود PAM لبناء نموذج دقيق لمرض الزرد باستخدام zSpRY-ABE8e.

تحرير قاعدة فعال بدون PAM لنمذجة الزرد للأمراض الوراثية البشرية باستخدام zSpRY-ABE8e

هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد طفرة الأم التي تجمع بين zpc: cas9 مستقرة مع التسليم بوساطة Tol2 لأشرطة تعبير sgRNA.

توليد طفرات الأمهات باستخدام zpc: cas9 Knock-in Zebrafish

اكتشف تحرير الجينوم باستخدام نوكليازات أصابع الزنك المخصصة CompoZr لإنشاء خطوط خلوية مُعطلة. تتيح هذه الطريقة للباحثين إجراء تعديلات جينية دقيقة ومتوقعة دون الحاجة إلى الاختيار.

الجينوم التحرير مع مخصص Nucleases CompoZr فنجر الزنك (ZFNs)

استكشف المزيد من الفيديوهات