Name: LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: تعلم كيفية إجراء شاشة اختيار إيجابية باستخدام مكتبة shRNA للجينوم الكامل في خلايا الثدييات. يوضح هذا البروتوكول تحديد الأهداف الجينية التي تعزز بقاء الخلايا وآليات مقاومة السمية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

المهمة هي علامة تجارية مسجلة لشركة التكنولوجيا الحيوية سيغما الدريخ LentiPlex هي علامة تجارية لشركة التكنولوجيا الحيوية سيغما الدريخ

<ol><li>Rao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+vs.+shRNA%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">siRNA vs. shRNA: similarities and differences.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).</li>
<li>Root, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+loss-of-function+screening+with+a+lentiviral+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library.</a> Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).</li>
<li>Fan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+antitumor+activity+of+TRAIL+combined+with+chemotherapeutic+agents+in+A549+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).</li>
<li>Ji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+of+shRNAs+targeting+tumor+suppressor+genes+to+identify+factors+involved+in+A549+paclitaxel+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity.</a> Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).</li>
<li>Fillmore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+expands+breast+cancer+stem-like+cells+through+paracrine+FGF%2FTbx3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).</li>
<li>Bhardwaj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+phosphatase+2A+activity+alters+androgen-independent+growth+of+prostate+cancer+cells%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer.+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications.</a> Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2%2C+a+putative+oncogene+encoding+a+member+of+a+subfamily+of+protein-serine%2Fthreonine+kinases%2C+is+amplified+in+human+ovarian+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).</li>
<li>Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+and+Akt2%3A+differentiating+the+aktion%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Akt1 and Akt2: differentiating the aktion.</a> Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).</li>
<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137 (5), 835-835 (2009).</li>
<li>Ketela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).</li>
</ol>

ويعمل ماثيو جيه Coussens ، كورمان كورتني واشلي فيشر L. ، ساجو جاك ، وجون Swarthout بواسطة سيغما الدريخ ، مما يجعل من الأدوات والكواشف المستخدمة في هذه المقالة.

في هذه الدراسة ، فإننا نقدم شاشة الجينوم واسعة لتحديد الجينات المسؤولة عن السمسة A549 من الخلايا التالية باكليتاكسيل / تريل العلاج. استخدام نهج المجمعة في شاشة الجينوم على نطاق يقلل من الوقت والتكلفة والاستثمار في المعدات التي ترتبط عادة مع الشاشات التقليدية التي تم حشدها. حاسمة بالنسبة لنجاح التجارب الشاشة هي الأمثل يؤديها سلفا. يجب أن تكون الظروف تنبيغ وزارة الداخلية تحدد تجريبيا. وينبغي اختيار الأسلوب يسمح للاختيار من الخلايا القوية التي تعرض النمط الظاهري المطلوب (على سبيل المثال ، والبقاء التعبير سطح البروتين ، الخ). والاستفادة المثلى من هذه المعلمات تقليل عدد ايجابيات كاذبة الكشف عنها. هنا ، كان حصادها gDNA من سكان الجزء الأكبر من الخلايا المحددة ثم TOPO المستنسخة لتحديد إدراج shRNA الفردية. كان من الممكن تحسين واحدة لهذه التجربة لتحديد الخلايا الحية لاستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لضمانيتم جمع إلا أن الخلايا الحية. وسيتم التحقق من الأهداف التي حددها تنبيغ مع shRNAs محددة الهدف في مقايسة الفرز. ويضرب عرض النمط الظاهري صحيحا في معظم الآبار. مكتبة LentiPlex مجمع يتسم بالمرونة في تطبيقها. وهو متوافق مع مجموعة واسعة من التطبيقات المصب ، ويمكن استخدامها مع استراتيجيات الاختيار إما إيجابية أو سلبية. تبعا للظروف الفرز ، ويتم إنجاز deconvolution لإدراج shRNA عبر PCR / الاستنساخ ، ميكروأري ، أو الجيل القادم التسلسل 9 و 10 وبينما هو راسخ في قوة وسرعة من هذه التقنيات لdeconvolute شاشات رني ، واحدة مع القلق وميكروأري الجيل القادم من أساليب التسلسل هو توافر الموارد المعلوماتية الحيوية والمعارف اللازمة لتحليل وتفسير النتائج بشكل صحيح التجريبية. يمكن أن تكون تكاليف هذه التقنيات المرتبطة في كثير من الأحيان يكون عائقا أمام القيام شاشات الجينوم واسعة. APCR / استنساخ النهج القائم ، في حين انها لم تكن بقوة ميكروأرس وتسلسل الجيل المقبل من هو بديل فعال وبتكلفة أقل. اجيلنت يقدم الآن مجموعة والمخصص اعتمادا على مكتبة shRNA TRC لتقديم المزيد من المساعدات في شاشات LentiPlex. هذه الخيارات تسمح للباحثين استخدام LentiPlex لدراسة مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">صفيف LentiPlex المجمعة</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">سيغما الدريخ</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> خلايا A549 </td><td> ATCC </td><td> CCL - 185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">سيغما الدريخ</a> </td><td><html> oductDetail.do؟ lang = ar في T5694 و N4 = ٪ 7CSIGMA وN5 = SEARCH_CONCAT_PNO ٪ 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">باكليتاكسيل</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">سيغما الدريخ</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> توبو TA الاستنساخ كيت </td><td> Invitrogen </td><td> K4575 - 01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Jumpstart من طق للخرسانة الجاهزة</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">سيغما الدريخ</a> </td><td>ONCAT_PNO 7CBRAND_KEY ٪ &amp; F = SPEC &quot;P2893&gt; </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute عدة Miniprep البلازميد</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">سيغما الدريخ</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadimethrine بروميد</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">سيغما الدريخ</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ TD&gt; </tr></tbody></table>

lentiplex بعثة مجمع shrna الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هو آلية جوهرية الخلوية لتنظيم التعبير الجيني. تسخير قوة فطرية لهذا النظام يتيح لنا ضربة قاضية لمستويات التعبير الجيني في فقدان دراسات وظائف الجينات. هناك طريقتين رئيسيتين لأداء رني. الأولى هي استخدام الصغيرة RNAs والتدخل (siRNAs) التي تم توليفها كيميائيا ، والثاني يستخدم قصيرة القاسي الرناوات (shRNAs) المشفرة داخل البلازميدات 1. يمكن transfected الأخير في الخلايا مباشرة أو حزم جسيمات في تكرار lentiviral غير كفء. المزايا الرئيسية لاستخدام shRNAs lentiviral هو سهولة إدخالها في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، وقدرتهم على الاندماج في جينوم ثابت لفترة طويلة الأجل واختيار الجينات ضربة قاضية ، ومدى فعاليتها في إجراء عالية الإنتاجية من الشاشات فقدان الوظيفة. لتسهيل هذا وضعنا LentiPlex المجمعة shRNA المكتبة. وMISسيون مكتبة LentiPlex shRNA الإنسان مجمع بركة الجينوم على نطاق lentiviral المنتجة باستخدام عملية الملكية. مكتبة يتكون من بنيات shRNA أكثر من 75،000 من الهيئة تستهدف جمع 15000 + 2 الجينات البشرية. يتم اختبار كل مكتبة للتمثيل shRNA قبل الافراج المنتج لضمان تغطية قوية المكتبة. وتقدم المكتبة في شكل جاهز للاستخدام في lentiviral التتر ما لا يقل عن 5 × 10 8 مل / TU عبر فحص P24 وقبل مقسمة إلى عشرة subpools حوالي 8000 shRNA يبني كل منهما. كما يتم توفير التضخيم وتسلسل الاشعال لتحديد الهدف المصب. أثبتت الدراسات السابقة نشاط انتيتومور المتآزر لTRAIL عندما يقترن باكليتاكسيل A549 في الخلايا ، وسرطان الرئة الخلية البشرية السطر 3 ، 4. في هذه الدراسة تثبت أننا في تطبيق مكتبة LentiPlex shRNA المجمعة لإجراء سريعا شاشة اختيار إيجابية للجينات تشارك في السمسة سو A549 الخلايا عند تعرضها للتريل وباكليتاكسيل. حاجز واحد واجه كثير من الأحيان مع شاشات عالية الإنتاجية والتكلفة وصعوبة في deconvolution ، ونحن من التفصيل أيضا نهجا فعالا من حيث التكلفة النسائل المتعددة باستخدام التسلسل التقليدي.

هنا نستخدم مكتبة LentiPlex الإنسان المجمعة التقليدية وأساليب التسلسل الجيني لتحديد أهداف تعزيز بقاء الخلية. نحن لشرح كيفية إعداد وdeconvolute شاشة LentiPlex والتحقق من صحة النتائج.

LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

يُعد تداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference - RNAi) آلية خلوية ذاتية لتنظيم التعبير الجيني. ومن خلال تسخير القوة الفطرية لهذا النظام، يمكننا ...

الهدف العام من الفيديو التالي هو توضيح كيفية استخدام مكتبة RNA ذات دبوس الشعر القصير (S-H-R-N-A) للجينوم الكامل لإجراء فحص اختيار إيجابي سريع. ويتم تحقيق ذلك عن طريق نقل 10 مجموعات فرعية من مكتبة S-H-R-N-A المجمعة للجينوم الكامل من نوع mission, lenti plex إلى الخلايا المستهدفة، يتبع ذلك إضافة المكون العلاجي. وكخطوة ثانية، يتم استعادة المادة القالب لـ HRNA، مما يسمح بفك تشفير الفحص المجمع.يتم بعد ذلك استنساخ S-H-R-N-A المسترجع في الناقل وتحويله إلى بكتيريا مختصة. بعد ذلك، يتم تحديد تسلسل عينات DNA البلازميدية وتحديد أهداف S-H-R-N-A باستخدام قاعدة بيانات البحث عن تسلسل HRNA، lenti PLX. وتكشف نتائج التجربة التي أجريت في هذا الفيديو عن الجينات المشاركة في السُمية الخلوية لخط خلايا ورم ظهاري عند تعرضها لعوامل دوائية مضادة للأورام بناءً على عدد نتائج التسلسل.تم تجميع Lin Duplex. تحتوي مكتبة HRNA على تجمع RNAI أو مجموعة TRC في 10 أنابيب مصفوفية، ويمكن استخدامها لإجراء دراسات عالية الإنتاجية لفقدان وظيفة الجينات بسرعة. في هذه الدراسة، تُستخدم لإجراء فحص اختيار إيجابي سريع للجينات المشاركة في السمية الخلوية لخلايا 5 49 عند تعرضها لـ trail وpaclitaxel قبل ترنسدكشن الخلايا المستهدفة.قم بتوزيع العدد المناسب من الأطباق بقطر 60 مليمتر مع عدد كافٍ من الخلايا للحصول على درجة تلاقي تقريبية تبلغ 70% في اليوم التالي. قم بتحضين الخلايا عند 37 درجة Celsius طوال الليل. ستختلف معدلات النمو حسب نوع الخلايا ويجب تحديدها قبل بدء عملية الفرز للتحضير لعملية ترنسدكشن الخلايا باستخدام مكتبة mission lenti plex pooled, S-H-R-N-A. قم بإذابة جزيئات الفيروسات البطيئة (lentiviral particles) على الثلج، ثم انقل الجزيئات المذابة إلى غطاء التدفق الصفائحي (laminar flow hood)، مع الحفاظ عليها على الثلج إذا لم يتم استخدامها على الفور.قم بحساب الكمية المطلوب إضافتها من كل تجمع فيروسي فرعي إلى الخلايا للحصول على تعددية عدوى (MOI) تبلغ one في جميع أطباق المزارع الخلوية. تُستخدم MOI منخفضة لتقليل احتمالية وجود عدة إنتغرينات في الخلية الواحدة؛ لذا قم بتخفيف كمية الفيروس المحسوبة في 100 إلى 300 µL من الوسط الغذائي الكامل لضمان توزيع أفضل للفيروس عند إضافته إلى طبق المزرعة الخلوية، ثم قم بإزالة الوسط الغذائي من الخلايا السابقة. أضف الوسط الغذائي الكامل الذي يحتوي على محلول poly brain إلى كل طبق من الأطباق.أضف جسيمات HRNA lentiviral إلى الأطباق المناسبة وفقاً للتصميم التجريبي المحدد مسبقاً. قم بتدوير الأطباق بلطف لتوزيع الفيروس بالتساوي على الخلايا. تُحضن العينات لمدة تتراوح بين 18 إلى 20 ساعة عند 37 درجة Celsius في حاضنة رطبة تحت جو يحتوي على 5%carbon dioxide.في اليوم التالي، يتم سحب الوسط الذي يحتوي على الفيروس وإضافة وسط كامل طازج بدون poly brain. تُحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية طوال الليل، وفي اليوم الرابع، يتم سحب الوسط من الخلايا وإضافة وسط طازج يحتوي على المكون العلاجي بتركيز أمثلي محدد مسبقاً. بعد ذلك، تُعامل الخلايا بالمكون لمدة زمنية محددة مسبقاً.في هذه الدراسة، تُعالج الخلايا بـ 100 nanograms per milliliter من trail و1 micromolar من paclitaxel لمدة 48 ساعة. وبعد المعالجة، يجب إعادة استزراع الخلايا الناجية في دوارق T 75 وتركها لتتضاعف حتى تصل إلى درجة تلاقي تقارب 100% لإجراء عملية فك الارتباط متعددة النسائل (polyclonal deconvolution). ثم يتم حصاد المجتمع غير المتجانس من الخلايا من كل مجموعة فرعية وعزل DNA الجينومي.ابدأ إجراء استعادة قالب S-H-R-N-A بإعداد تفاعل PCR كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. تتضمن مجموعة lenti plex بادئات تضخيم بتركيز 20 millimolar. قم بإعداد ضابط موجب باستخدام ناقل mission SHRA human positive control المخفف إلى التركيز المناسب ليكون بمثابة قالب.يشير التضخيم الناجح باستخدام هذا القالب إلى أن مكونات مقايسة PCR وظروف الدورات مناسبة. احفظ برنامج PCR المدرج في البروتوكول المكتوب في جهاز التدوير الحراري وقم بإجراء تضخيم الهدف. بمجرد اكتمال الدورة، اخلط 3 µL من كل تفاعل PCR مع 1 µL من الصبغة، ثم أجرِ الفصل الكهربائي جنباً إلى جنب مع سلم منخفض بوزن 100 bp على هلام أغاروز بتركيز 1% لتأكيد وجود ناتج تضخيم بطول 309 bp.في هذه المرحلة، يتم استنساخ نواتج الـ PCR الفرعية؛ حيث تُستنسخ نواتج الـ PCR باستخدام مجموعة topo ta cloning kit وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. والنتيجة هي احتواء كل ناقل على ناتج PCR واحد. وبمجرد اكتمال عملية الاستنساخ الفرعي، يتم عزل 250 مستعمرة بكتيرية فردية، تحتوي كل منها على ناتج PCR فردي.قم بتنمية المستعمرات الفردية في مزارع بحجم 2 mL، والتي يمكن استخلاص الحمض النووي البلازميدي منها باستخدام مجموعة Gen Elute plasmid mini prep. وبعد هضم الحمض النووي البلازميدي المنقى بواسطة enzyme EcoR1، يمكن تأكيد وجود القطعة المدرجة عن طريق الرحلان الكهربائي. وأخيرًا، من عينات الحمض النووي البلازميدي المتسلسلة، يمكن تحديد قطعة S-H-R-N-A المدرجة باستخدام قاعدة بيانات Plex HRNA sequence search المتوفرة مع مكتبة PLX. ابحث عن مربع البحث في نموذج قاعدة بيانات الوصول للبحث عن تسلسلات S-H-R-N-A المرفق للوصول إلى بداية تسلسل HRNA.أدخل من 10 إلى 21 نيوكليوتيد التالية من تسلسل الاستعلام. ثم اختر نوع الكائنات الحية لـ S-H-R-N-A المجمعة. يمكنك اختيار المجمع الفرعي الذي تم العثور على التسلسل فيه، حسب الرغبة.انقر الآن على زر البحث عن النتائج المحتملة (find potential hits) لإجراء عملية البحث. من شأن هذه الخطوة تحديد تسلسلات T-R-C-S-H-R-N-A المقابلة التي تتطابق مع بيانات التسلسل. يمكن بعد ذلك استخدام موقع Sigma aldrich، موقع الجينات المفضل لديك، للعثور على مزيد من المعلومات حول تسلسلات TR CS HRA التي تم تحديدها والأهداف الجينية المقابلة لها. يجب التحقق من صحة الجينات المستهدفة المحددة عن طريق تكرار مقايسة الفرز الأصلية باستخدام مستنسخ TRC الأصلي بالإضافة إلى اثنين على الأقل من جزيئات RNAs إضافية تستهدف الجين نفسه، وذلك باستخدام تنسيق جزيء HRNA واحد لكل طبق بقطر 60 millimeter.ستُظهر النتائج الإيجابية الحقيقية النمط الظاهري ذاته في غالبية الأطباق. تم عزل المستعمرات التي تحتوي على ناقل الاستنساخ مع قطعة PCR واحدة باستخدام إجراء استعادة قالب SHRA، وتم تحديد المدرج HRNA باستخدام قاعدة بيانات البحث عن تسلسلات lenti plex SHRA. وقد تم تسلسل 250 مستعمرة.ومن بين هذه الجينات، تم تمثيل 25 منها بواسطة نسخ متعددة، بينما تم تمثيل الـ 225 المتبقية بواسطة نسخة واحدة فقط ولم يتم تتبعها. وكما هو موضح هنا، تم تمثيل العديد من الجينات المرشحة، بما في ذلك TBX three وPPP two وca وAKT two بواسطة نسخ متعددة. وقد ظهر عامل النسخ T box المسمى TBX three في إجمالي أربعة نسخ، وقد تم ربطه بهجرة الأورام.لقد ثبت أن تثبيط تعبير PPP2CA يحافظ على نمو خلايا LNCaP المستزرعة في ظروف تفتقر إلى الأندروجين، وذلك من خلال تخفيف توقف الدورة الخلوية الناجم عن الحرمان من الأندروجين ومنع الموت الخلوي المبرمج. علاوة على ذلك، فإن AKT2 هو بروتين كيناز سيرين/ثريونين/ألانين ويُعد جينًا سرطانيًا مفترضًا ثبت أنه يلعب أدوارًا متعددة في تطور السرطان. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام هذه الطريقة.مكتبة shRNA مجمعة من Len Plex لإجراء دراسات فقدان وظيفة الجينات عالية الإنتاجية بسرعة.

mission-lentiplex-pooled-shrna-library-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هنا نستخدم مكتبة esiRNA الإنسان في شاشة عالية الإنتاجية للجينات لها دور في انقسام الخلايا. نحن لشرح كيفية إعداد وإجراء شاشات esiRNA ، فضلا عن كيفية تحليل والتحقق من صحة النتائج.

esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات

مكتبة معرف الهدف هو البلازميد ومقرها الجينوم على نطاق جمع من [كدنا] المستنسخة يستخدم لتحديد أهداف ميرنا. هنا علينا أن نبرهن كيفية استخدامه وتطبيقه.

الجينوم على نطاق الشاشة لأهداف ميرنا باستخدام معرف الهدف المكتبة MISSION

نحن تقرير الحمض النووي الريبي دبوس صغير (شرنا) والبروتوكول على أساس تسلسل الجيل القادم لتحديد الجهات التنظيمية للمنظمة إكستشروموسومي في خط خلية مورين مع لوسيفراس اليراع وتنصهر فيها جينات مقاومة هيجروميسين الميثيل البد ملزمة البروتين 2 ( MeCP2) الجينات على كروموسوم X غير نشط.

شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

مكتبة كريسبر/سجرنا طبق لاستجواب الجينات ترميز البروتين. بيد أن جدوى مكتبة سجرنا للكشف عن الوظيفة لحد كتكف في تنظيم الجينات لا تزال غير مستكشفة. هنا، يمكننا وصف مكتبة HOX سجرنا محددة المكاني لتوضيح وظيفة الحدود كتكف في HOX المكاني.

HOX المكاني مركزة كريسبر/سجرنا "مكتبة الفرز تحديد الحرجة كتكف الحدود"

توفر تقنية CRISPR-Cas9 طريقة فعالة لتحرير الجينوم الثدييات بدقة في أي نوع من أنواع الخلايا وتمثل وسيلة جديدة لأداء الشاشات الوراثية على نطاق الجينوم. ويرد هنا بروتوكول مفصل يناقش الخطوات اللازمة للنجاح في أداء شاشات كريسبر-كاس9 المجمعة على نطاق الجينوم.

الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

لتحديد المنظمين الرواية من عوامل النسخ، وضعنا نهجا لفحص صفيفlentiviral أو retroviral المكتبات RNAI باستخدام النسخ المزدوج القائم على luciferase. هذا النهج يوفر طريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا لفحص مئات المرشحين في تجربة واحدة.

تحديد منظمي عوامل النسخ باستخدام فحص متوسط الإنتاجية للمكتبات المصصفوفة ومراسل ثنائي لوسيفراز القائم

يمكن أن يكون فحص تداخل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNAi) باستخدام مجموعة من الحمض النووي الريبوزي المرسال (shRNAs) الفيروسي الوراثي أداة للكشف عن الأهداف القاتلة الاصطناعية ذات الصلة علاجيا في الأورام الخبيثة. نحن نقدم نهج فحص shRNA مجمع للتحقيق في المؤثرات اللاجينية في سرطان الدم النخاعي الحاد (AML).

فحص مكتبة shRNA المجمعة لتحديد العوامل التي تعدل النمط الظاهري لمقاومة الأدوية

باستخدام البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI) ، أنتجنا جزيئات فيروسية لينتيفيروسية للتعبير المستقر عن shRNAs في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H9 (hESCs) والخلايا السلفية العصبية المشتقة من H9 (NPCs) بكفاءة عالية.

تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال بوساطة فيروسية إلى hESCs و NPCs باستخدام بولي إيثيلينيمين البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة (PEI)

لقد طورنا نهجا مقارنا لعلم الأورام الجيني عبر الأنواع باستخدام التحليلات الجينومية والشاشات الجينومية الوظيفية لتحديد ومقارنة الأهداف العلاجية في الأورام الناشئة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا ونوع الورم البشري المقابل.

التنميط الجيني وفحص التسرب على نطاق الجينوم لتحديد الأهداف العلاجية في نماذج الفئران لورم غمد العصب المحيطي الخبيث

تقدم هذه الدراسة نظام CRISPRi مزدوج يستهدف الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر في خلايا الورم الميلانيني. إنه يتيح الضربة القاضية الجينية الاندماجية والفحص القاتل الاصطناعي ، وتحديد تفاعلات lncRNA الخاصة بالسرطان للاستراتيجيات العلاجية المحتملة.

استراتيجية تداخل CRISPR المزدوجة لاستهداف التفاعلات المميتة الاصطناعية بين الحمض النووي الريبي غير المشفر في الخلايا السرطانية

يصف هذا البروتوكول نهج فحص CRISPR القابل للتوسع داخل القنوات، مما يتيح دراسات موازية لإزالة وتنشيط الجينات في الجسم الحي في غدة الثدي الفأرية.

الفحص المتوازي في الجسم الحي لإزالة الجينات وتفعيله في غدة ثديي الفأر

تعلم كيفية إجراء شاشة اختيار إيجابية باستخدام مكتبة shRNA للجينوم الكامل في خلايا الثدييات. يوضح هذا البروتوكول تحديد الأهداف الجينية التي تعزز بقاء الخلايا وآليات مقاومة السمية.

LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات

استكشف المزيد من الفيديوهات