تغيير اتجاه واتجاه الحقل الكهربائي خلال التطبيق البقول الكهربائية البلازميد يحسن نقل الجينات في المختبر
سبتمبر 12, 2011
تم تحسين ترنسفكأيشن الجينات التي electroporation حوالي مرتين عند تغيير اتجاه الحقل الكهربائي خلال تطبيق النبض ، بينما لا يتأثر بقاء الخلية. ويتسبب في زيادة ترنسفكأيشن الجينات التي تزيد من مساحة الغشاء الذي يتكون المختصة لإدخال الحمض النووي في الخلية.
يُعد نقل الجينات عبر الأقطاب الكهربائية طريقة فيزيائية تُستخدم لإيصال الجينات إلى الخلايا عن طريق تطبيق نبضات كهربائية قصيرة وكثيفة. ويتضمن النقل الناجح للجينات عبر الأقطاب الكهربائية عدة خطوات، وهي: تكوين معقد بين الـ DNA وغشاء الخلية، وانتقال الـ DNA عبر الغشاء الذي تم تثقيبه كهربائياً، وانتقال الـ DNA من السيتوبلازم إلى النواة، وأخيراً التعبير الجيني لنقل الجينات كهربائياً. وتُستخدم بروتوكولات نبضات كهربائية مختلفة من أجل تحقيق أقصى قدر من ترنسفكشن الجينات.
أحد هذه الإجراءات هو تغيير اتجاه المجال الكهربائي أثناء إيصال النبضات. في هذا الفيديو، نوضح الفرق في كفاءة نقل الجينات عبر الأقطاب الكهربائية عند إيصال جميع النبضات في الاتجاه نفسه وعند إيصال النبضات بطرق مختلفة. ومن خلال تغيير اتجاه المجال الكهربائي، أُجريت التجارب على خلايا مبيض الهامستر الصيني، CHOK one الخاصة بالتجربة.
اتبع هذه الخطوات، قم بتنمية الخلايا في قارورة زراعة داخل الحاضنة لمدة 24 ساعة. وفي يوم التجربة، قم بتحضير معلق خلوي باستخدام التريبسين بمحلول trypsin-EDTA بتركيز 0.25% وقم بعدّ الخلايا، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 1000 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة 4 °C وأعد تعليق رواسب الخلايا في محلول sodium phosphate buffer (ISO OSM Miller) لتصل كثافة الخلايا إلى 5 مليون خلية لكل mL. ثم انقل العينة إلى الطبق المناسب، حيث يتم تعريض الخلايا لمجال كهربائي في طرف ماصة (pipe tip) مزود بأقطاب كهربائية مدمجة ومتصلة بجهاز توليد جهد عالٍ تجريبي.
تسمح هذه الأقطاب بتطبيق مجال كهربائي متجانس نسبيًا في اتجاهات مختلفة. وقد تم تطوير الطرف والمولد في مختبر كلية السيبرنيكا الحيوية في كلية الهندسة الكهربائية بجامعة لوانا. أضف البلازميد E-G-F-P-N 1 إلى معلق خلوي بتركيز 10 micrograms per milliliter.
امزج الخلايا مع DNA البلازميد جيداً وحضن الخليط لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل تطبيق النبضات الكهربائية. اسحب 100 µL من معلق الخلايا إلى طرف الماصة المزود بأقطاب كهربائية مدمجة. في هذه التجربة، يتم تطبيق سلسلة مكونة من ثماني نبضات مستطيلة باستخدام مولد نماذج عالي الجهد، حيث تُستخدم بروتوكولات مجالات كهربائية مختلفة في البروتوكول الأول.
يتم تسليم جميع النبضات في الاتجاه نفسه، بينما يتم تسليم النبضات في البروتوكول الثاني عن طريق تغيير اتجاه المجال الكهربائي. لا يمكن استخدام البروتوكول الثاني إلا مع مولد نبضات مناسب، والذي يسمح بتطبيق نبضات كهربائية في اتجاهات مختلفة. مباشرة بعد تطبيق النبضات، انقل الخلايا من طرف الأنبوب إلى أطباق ذات ستة آبار وأضف مصل الجنين البقري.
قم بحضن الخلايا بنسبة 25% من حجم العينة لمدة خمس دقائق عند 37 °C. للسماح بإعادة غلق غشاء الخلية، أضف 2 mL من HAMF 12 إلى كل عينة في طبق سداسي الفجوات، ثم احضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 °C في حاضنة ذات جو مرطب يحتوي على 5% CO2. يتم تحديد كفاءة النقل الكهربائي للجين كنسبة مئوية للخلايا التي تعبر عن GFP بعد 24 ساعة من تطبيق النبضة.
تُفحص الخلايا باستخدام مجهر فلوري عبر برنامج الحصول على الصور. اضبط طول موجة الاستثارة على 488 نانومتر، واختر مرشح تمرير نطاق مناسب للصور الفلورية الخضراء للكشف عن الخلايا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر GFP. قم بالتقاط خمس صور على الأقل، تشتمل على تباين الطور والفلورة الخضراء بتكبير 20 مرة.
عدّ الخلايا في صورة تباين الطور (phase contrast) والخلايا التي تعبر عن GFP في صورة الفلورة الخضراء باستخدام تكبير الشيئية، ثم حدد نسبة كفاءة الترحيل الكهربائي للجين عن طريق قسمة عدد الخلايا التي تعبر عن GFP على إجمالي عدد الخلايا في كل صورة مقابلة. يتم عرض نسبة الخلايا التي تعبر عن GFP عندما يتم تقديم جميع النبضات في نفس الاتجاه وعندما يتم تقديم النبضات عن طريق تغيير اتجاه المجال الكهربائي؛ وتزداد نسبة الخلايا التي تعبر عن GFP بشكل ملحوظ عند تغيير اتجاه المجال الكهربائي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في عملية ترانسفكشن الجينات عبر التثقيب الكهربائي، مع تسليط الضوء على تأثير اتجاه المجال الكهربائي على كفاءة عملية الترانسفكشن. وتشير النتائج إلى أن تغيير اتجاه المجال الكهربائي أثناء تطبيق النبضات يمكن أن يضاعف معدلات ترانسفكشن الجينات دون المساس بحيوية الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- العلاج الجيني
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات التثقيب الكهربائي
خلفية علمية
- يعد النقل الجيني الكهربائي طريقة لإدخال الجينات إلى الخلايا.
- ويتضمن ذلك تطبيق نبضات كهربائية قصيرة ومكثفة لتسهيل دخول DNA.
- يتطلب نجاح عملية transfection عبور DNA للغشاء الخلوي ودخوله إلى النواة.
- يمكن لبروتوكولات النبضات الكهربائية المختلفة أن تعزز كفاءة transfection.
الغرض من الدراسة
- تقييم تأثير اتجاه المجال الكهربائي على كفاءة عفن الجينات.
- تحديد ما إذا كان تغيير الاتجاه يؤثر على حيوية الخلايا.
- توضيح هذه العملية باستخدام خلايا مبيض هامستر الصين (CHO).
الطرق المستخدمة
- تطبيق النبضات الكهربائية على خلايا CHO.
- مقارنة كفاءة عفن التحول (transfection) مع تغيير اتجاهات المجال الكهربائي.
- تقييم حيوية الخلايا بعد عملية عفن التحول.
- تحليل دخول DNA إلى الخلايا والتعبير الجيني اللاحق.
النتائج الرئيسية
- تحسنت كفاءة ترانسفكشن الجينات بنحو ضعفين عند تغيير اتجاه المجال الكهربائي.
- لم يلاحظ أي تأثير معنوي على حيوية الخلايا.
- ساهمت زيادة مساحة الغشاء في تعزيز دخول الـ DNA.
- تم إثبات فعالية بروتوكولات نبضات كهربائية مختلفة.
الاستنتاجات
- يؤدي تغيير اتجاه المجال الكهربائي أثناء تطبيق النبضات إلى تعزيز عملية ترانسفكشن الجينات بشكل كبير.
- يمكن تحسين هذه الطريقة دون المساس بصحة الخلايا.
- قد تستكشف الأبحاث المستقبلية بروتوكولات إضافية لتحسين عملية توصيل الجينات.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
يؤدي تحسين توجيه المجال الكهربائي أثناء عملية التثقيب الكهربائي (electroporation) إلى تعزيز كفاءة نقل جينات البلازميد، مما يوفر استراتيجية غير فيروسية لتحسين عوائد عفن الخلايا (transfection) في سير عمل التحقق من الأهداف وتحديد المركبات الرائدة في المراحل المبكرة. ويدعم هذا النهج تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال زيادة دخول DNA عبر توسيع كفاءة الغشاء دون المساس بحيوية الخلايا، مما يعزز الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية. تتيح هذه الطريقة توصيلاً جينياً قابلاً للتكرار والتوسيع لتطوير المقايسات وتطبيقات الفحص المظهري في عمليات البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تزيد من مساحة الغشاء المهيأة لدخول DNA، مما يحسن كفاءة عفن الخلايا ويدعم التحقق الوظيفي من الأهداف في دراسات تعبير البروتين المؤتلف.
- القيمة التشغيلية: تتيح توصيلاً متسقاً للبلازميد عبر المجموعات الخلوية، مما يقلل من التباين في مراحل اختبار الفرضيات المبكرة وتوضيح المسارات.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر قراءات كمية تعتمد على الفلورة لكفاءة نقل الجينات، وهي متوافقة مع منصات الفحص عالية المحتوى.
- القيمة التشغيلية: يعمل على توحيد معايير التثقيب الكهربائي باستخدام رؤوس أقطاب كهربائية مدمجة ومولدات نبضات قابلة للبرمجة، مما يحسن من إمكانية تكرار المقايسة عبر المختبرات المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: يدعم التحضير القابل للتوسع لخطوط الخلايا المنقولة جينياً لاستخدامها في مقاييس الارتباط بالهدف والمؤشرات الحيوية اللاحقة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يحافظ على حيوية الخلايا بعد عملية transfection، مما يسمح بإجراء دراسات طولية للتعبير الجيني والتأثيرات المظهرية في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض.
- القيمة التشغيلية: يسهل إنشاء نماذج قبل سريرية معدلة وراثياً بشكل مستقر أو عابر باستخدام خلايا CHO، وهي مضيف مستخدم على نطاق واسع لإنتاج المستحضرات البيولوجية وتحليل المسارات.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشافات بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيثما يتطلب الأمر توصيلاً فعالاً للجينات لتقييم وظيفة الهدف وتعديل المسارات في النماذج الخلوية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال تمكين التعبير المفرط أو إسكات الجينات المستهدفة بشكل موثوق في الخلايا الثديية.
- الفحص: يوفر مخرجات ترانسفكشن (transfection) كمية ومعيارية تسمح بمقارنة البنى الجينية أو العناصر التنظيمية.
- التحليلات: يولّد مقاييس كفاءة قائمة على النسبة المئوية (خلايا GFP+ / إجمالي الخلايا) تتيح المقارنة الإحصائية بين بروتوكولات النبض.
- البحث الانتقالي: يربط الاستمرارية قبل السريرية من خلال إنتاج خلايا منقولة جينياً قابلة للحياة ومناسبة لمزيد من التحقق في النماذج ثلاثية الأبعاد أو أنظمة الزراعة المشتركة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يمثل قدرة قابلة لإعادة الاستخدام في التثقيب الكهربائي (electroporation) يمكن تطبيقها عبر مشاريع متعددة تتطلب إيصال البلازميد إلى خطوط الخلايا الملتصقة أو المعلقة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في نتائج إيصال الجينات عن طريق زيادة كفاءة عفن الخلايا (transfection) من خلال التحسين الفيزيائي الحيوي لمعاملات النبضات.
- القيمة التشغيلية: تحسن قابلية التكرار والتوحيد القياسي لإجراءات نقل الجينات من خلال سلاسل نبضات محددة والتحكم في توجيه المجال.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من المخاطر البيولوجية في التحقق من الأهداف عن طريق ضمان تعبير كافٍ للجين المنقول للتقييم المظهري، مما يقلل من النتائج السلبية الكاذبة.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأهداف الجينية المعدلة حسب المخاطر بناءً على مستويات التعبير القابلة للتحقيق في المقاييس الخلوية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الثديية، وتحضير البلازميدات، والمجهر الفلوري لتقييم كفاءة عفن الخلايا (transfection).
- يعتمد على توفر مولدات نبضات ذات جهد عالٍ قادرة على تغيير اتجاه المجال الكهربائي القابل للبرمجة، ورؤوس متوافقة مدمجة بالأقطاب الكهربائية.
- يستلزم توحيد معلمات النبض (الجهد، والمدة، والعدد) وكثافة الخلايا عبر التجارب لضمان قابليتها للمقارنة.
- يتضمن تحسين نسبة DNA إلى الخلايا وأوقات الحضانة لتحقيق التوازن بين كفاءة عفن الخلايا والإجهاد الخلوي.
- يقتصر على خطوط الخلايا الملتصقة أو المعلقة المتوافقة مع التثقيب الكهربائي (electroporation)؛ وقد تتطلب الخلايا الأولية أو الحساسة طرق توصيل بديلة.
