التصوير فرمون الاستشعار في الميكعي ماوس الحادة الأنسجة إعداد شريحة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد شرائح نسيجية حادة من العضو الأنفي الخلفي (RO) أو العضو الأنفي المرتكز (VNO) للفأر، وذلك لإجراء تجارب تصوير الكالسيوم على مجموعات فرعية أو عصبونات فردية في النسيج الحي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استخراج VNO من أنف الفأر، ثم تشريحه مجهرياً من كبسولته الغضروفية تحت مجهر تشريحي في سائل CSF بارد. بعد ذلك، يتم وضع VNO المعزول رأسياً في كتلة أغار، وتُقطع شرائح نسيجية إكليلية حادة باستخدام الميكروتوم للتحقق من سلامة النسيج.

يتم فحص بضع شرائح بعد إجراء الكيمياء النسيجية المناعية تحت مجهر بؤري. وتُحمّل شرائح أخرى بصبغة حساسة للكالسيوم، ثم تُعطّر بمرتبطات فيرومونية مفترضة، ويُرصد التنشيط العصبي باستخدام تصوير الكالسيوم. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في حل القضايا الرئيسية في مجال الشم.

على سبيل المثال، يتم التعبير عن مئات من مستقبلات الفيرومونات في العضو الأنفي الرومي، ولكن قلة قليلة منها فقط لها ربيطات محددة. ومن الصعب جداً التعبير عن مستقبلات الفيرومونات في نظام غير متجانس. لذا، كنا بحاجة إلى تطوير مقايسة فعالة في الجسم الحي لتعيين فيرومونات محددة لمستقبلات معينة.

يمكننا استخدام فئران معدلة وراثياً حيث يعبر تجمع فرعي محدد من الخلايا العصبية عن مستقبلات غير معروفة، ويمكن التعرف عليها من خلال التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر GFP. كما يمكننا استخدام هذا الاختبار للبحث الدوائي في القنوات الأيونية والإنزيمات المشاركة في سلسلة نقل الإشارات في Fairmont، مما يوضح الإجراء المتبع. سيكون معنا اليوم جوليان وفابيان، وهما باحثان من مختبري، قبل البدء في عملية التشريح.

قم بتحضير سائل دماغي شوكي اصطناعي طازج وبارد، بحيث يكون السائل الدماغي الشوكي (CSF) مشبعاً بـ oxy carb عن طريق دمج جميع المكونات باستثناء كلوريد الكالسيوم. قم بتشبيع المحلول عن طريق تمرير فقاعات oxy carb فيه مباشرة. ثم أضف كلوريد الكالسيوم واضبط الحجم النهائي باستخدام ماء مقطر مزدوج للوصول إلى الحجم المطلوب.

يُحفظ محلول A CSF على الثلج حتى وقت الاستخدام. بعد القتل الرحيم وفصل الرأس لفأر بالغ، يتم تحضير طبق بتري يحتوي على محلول A CSF بارد ومشبع باستمرار بالأكسجين وثاني أكسيد الكربون. بعد إزالة الفك السفلي، يوضع رأس الفأر في طبق بتري.

ضع رأس الفأر تحت مجهر التشريح من أجل رؤية الحنك. بعد ذلك، قم بإجراء شق أفقي في الجزء العلوي من الحنك باستخدام مقص دقيق، ثم قم بإزالة غشاء الحنك باستخدام ملقط تشريح دقيق. قم بترطيب وتنظيف التجويف المكشوف باستخدام A CSF.

اقطع الجزء العلوي والسفلي من الحاجز الأنفي. ثم استخرج بحذر الحاجز الأنفي الذي يحتوي على VNO وضعه مباشرة وبشكل رأسي في A CSF نظيف. افصل جزئي VNO باستخدام ملقط التشريح الدقيق.

حدد المحفظة الغضروفية للعضو الأنفي الوهامي (VNO) ثم قم بإزالتها بعناية، مع التأكد من إزالة جميع القطع الغضروفية. يظهر هنا العضو الأنفي الوهامي المعزول، والقطع الغضروفية، والعضو الأنفي الوهامي غير المشرح. أولاً، قم بتحضير Agar منخفض الانصهار بتركيز 3%، ثم جهّز مساحة العمل بالأدوات اللازمة. املأ قالب الطمر بالـ Agar وتأكد من أن درجة الحرارة أقل من 41 °C قبل غمر العضو الأنفي الوهامي المشرح. ضع النسيج رأسياً من أجل الحصول على مقاطع إكليلية.

ضع قالب التضمين على الثلج لمدة دقيقة واحدة حتى يتصلب الآجار. بعد مرور دقيقة واحدة، قم بإزالة كتلة الآجار، وقص الآجار على شكل شبه منحرف، ثم قم بلصقه بمسند الميكروتوم. قم بقطع شرائح إكليلية من العصب الأنفي المزلق (VNO) باستخدام الميكروتوم بسرعة 0.5 millimeters per second، وسعة 0.7 millimeters، وسماكة 100 micrometers في سائل CSF بارد.

اجمع شرائح الأنسجة باستخدام فرشاة وضعها في طبق زراعة أنسجة مملوء بـ A CSF بارد للتحقق من السلامة البنيوية لشرائح الأنسجة المجمعة، والتي يمكن تثبيتها بعد ذلك ثم صبغها مناعياً للكشف عن مكونات الهيكل الخلوي أو البروتينات الأخرى ذات الصلة. هنا، يوضح الصبغ المناعي ضد acetylated tubulin باللون الأرجواني السلامة البنيوية لشريحة النسيج. علاوة على ذلك، فإن ملاحظة مجموعة عصبية محددة حيث تم وسم مستقبل فيروموني معين بواسطة GFP تظهر المورفولوجيا العصبية المحفوظة؛ حيث يمكن ملاحظة عصبونات ذات أجسام خلوية بيضاوية صغيرة وزوائد شجرية طويلة تصل إلى سطح التجويف وتنتهي بخملات دقيقة عند العمل في غرفة مظلمة.

يتم تحضين شرائح VNO في محلول تحميل من A CSF البارد يحتوي على 7 µM من URA 2:00 AM و 0.1%onic لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. بعد مرور ساعة، تُحفظ الشرائح المحملة على الثلج مع الأكسجين والكربنة حتى وقت الاستخدام. تُستخدم فرشاة رسم لوضع الشرائح المحملة في غرفة تروية تحتوي على A CSF، ثم تُثبت الشرائح باستخدام مثبت شرائح الأنسجة.

ضع غرفة التروية على منصة المجهر في نظام تصوير الكالسيوم، وقم بالتروية المستمرة باستخدام A CSF مكربن ومؤكسج في درجة حرارة الغرفة. افحص شرائح VNO المحملة باستخدام أطوال موجات الفلورة المقابلة للصبغة، وهي 340 إلى 380 نانومتر لـ 4 O 2:00 AM. استخدم البرنامج المناسب لتسجيل التغيرات في نسبة الكالسيوم داخل الخلايا. يعد نظام التروية ضروريًا لتحفيز التحفيز الكيميائي.

يظهر هنا مقطع إكليلي لنسيج vno من فأر تعبر فيه المجموعة الفرعية من العصبونات التي تعبر عن مستقبل الفيرومون V one RB two عن GFP أيضاً، حيث تم إجراء صبغ مناعي ضد بروتين tubulin المُؤستَل والذي يظهر باللون الأرجواني. وتوضح المناظر ذات التكبير العالي للمقطع الحفاظ على سلامة النسيج. كما تظهر العصبونات ذات التغصنات الطويلة وهي تصل إلى سطح اللمعة، ويمكن رؤية تعبير البروتين البنائي في العقد التغصنية والخملات الدقيقة المستخدمة في تصوير الكالسيوم.

يتم أولاً فحص شرائح الأنسجة المحملة بـ FU باستخدام تباين طور هوفمان (Hoffman phase contrast) لتحديد الحقل المستهدف بدءاً من الوعاء الدموي، السهم الأبيض الأول، ثم يتقدم الفاحص ببطء نحو التجويف، السهم الأبيض الثاني، ومنطقة الظهارة العصبية. يمكن التعرف على جسم الخلية البيضاوي للعصب الأنفي في RO، السهم الأبيض الثالث، من خلال استطالته ودقته.

السهم الأبيض الرابع يمتد إلى التجويف، وهو النتوء الشجيري العصبي. يشير السهم الأبيض الخامس إلى الزغابات المعوية الملامسة للخلايا المحملة بالفيرومونات RA، والموضحة هنا عند 80 نانومتر، ثم يتم إضاءتها بالتتابع عند 40 و80 نانومتر، وتتم مطابقة نسبة الطول الموجي الفلوري هذه مع تغيرات الكالسيوم داخل الخلايا في الأعصاب المختارة، الممثلة بالدوائر السوداء والحمراء والزرقاء. يتم استخدام A TP لتحديد حيوية الخلايا العصبية.

لاحظ نطاق استجابات الكالسيوم الظاهرة عبر الخلايا العصبية الثلاث المختارة، وحقيقة أن الخلية العصبية رقم اثنين (الدائرة الحمراء) لا تستجيب لـ TP، وبالتالي سيتم استبعادها من التحليلات اللاحقة. ثم يتم تحقيق التحفيز الكيميائي باستخدام كل من البول ومزيج من فيرمونات الفئران مع الفحص في عمق شريحة النسيج. ويمكن تحديد موقع مجموعة فرعية من الخلايا العصبية التي تعبر عن كل من GFP ومستقبل V one RRB two.

يظهر هنا عصبون يعبر عن كل من GFP ومستقبل V1RB2 إلى جانب عصبون لا يعبر عن V1RB2. تم تحميل كلا الخليتين بـ URA 2:00 AM، ويظهر العصبون الذي يعبر عن V1RB2 ارتفاعاً حاداً في مستوى الكالسيوم استجابةً لتروية الربيطة 2-hep known الخاصة بالمستقبل. ومن المثير للاهتمام أن العصبون الذي لا يعبر عن V1RB2 يستجيب أيضاً لـ 2-hep known، مما يوضح تعقيد ترميز الفيرمونات في VNO.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج وتشريح الفأر مجهرياً للحصول على عضو خلايا mar من أجل تحضير شرائح نسيجية حادة. هذا البروتوكول قابل للتعديل أيضاً لإجراء الاستقصاءات الفسيولوجية باستخدام صبغات كالسيوم بديلة وتجهيزات مجهرية مختلفة. بالتوفيق في تجربتك.