القولون والمستقيم سطح الخلية السرطانية باستخدام بروتين التنميط ميكروأري جسم والمتعدد الإسفار

يتمثل هدفك العام من التجربة التالية في استخدام مصفوفة الأجسام المضادة DOT scan للتوصيف الجزيئي للمستضدات السطحية في أنسجة سرطان القولون والمستقيم. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام التعدد الإشاعي الفلوري للتمييز بين أنواع الخلايا ذات التوصيفات المحددة ضمن المجتمع الخلوي المختلط. وقد تم تحديد مستضدات مجموعة التمايز أو CD كمؤشرات حيوية محتملة للإنذار أو الانتشار في سرطان القولون والمستقيم.

تعد هذه المستضدات علامات حيوية مثالية لأن تعبيرها غالبًا ما يتغير مع تطور الورم أو التفاعل مع أنواع الخلايا الأخرى. في هذا الفيديو، نستخدم مصفوفة أجسام مضادة من نوع DOT scan لالتقاط الخلايا الحية عبر المستضدات السطحية المُعبر عنها. وتتكون مصفوفة الأجسام المضادة DOT scan من شريحة زجاجية مغطاة بطبقة من النيتروسليلوز.

تتم محاذاة لوحة مصفوفة الأجسام المضادة الدقيقة لـ DOT scan بواسطة نقاط محاذاة تتكون من CD 29 و CD 44. كما توجد مصفوفات مكررة منقطة على كل جانب من جوانب المصفوفة. تتكون اللوحة الأولى من الـ 82 جسماً مضاداً الأصليين الخاصين بمصفوفة DOT scan لسرطان الدم، وتم اختيار 40 جسماً مضاداً إضافياً بناءً على إمكانية التنبؤ بالنتائج كمصفوفة تابعة لسرطان القولون والمستقيم.

وتتكون اللوحة الأخيرة من أجسام مضادة ضابطة من النوع الجليدي. هنا، يتم هضم أنسجة سرطان القولون والمستقيم والمخاطية المعوية الطبيعية وترشيحها للحصول على معلق خلايا مفردة حي. ويمكن تجميد هذا المعلق أو تخزينه لوقت لاحق.

يُستخدم معلق الخلايا لالتقاط الخلايا على مصفوفة أجسام مضادة مجهرية من نوع DOT scan، حيث يتم تحليل الأنتيجينات المُعبر عنها في الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا عن طريق تعدد الإرسال الفلوري. وتظهر ملفات التعبير الناتجة تغييراً ملحوظاً في التعبير عن الأنتيجين بين خلايا سرطان القول والمستقيم والمخاطية المعوية الطبيعية. ينعكس هذا الاختلاف أيضاً في مجموعة الكريات البيضاء المرتبطة بالورم.

يظهر التجميع الهرمي لعدة ملفات تعريفية للأورام تجميعاً لبصمات المرض مع مراحل سرطان القولون والمستقيم. مرحباً، أنا جيري من كلية العلوم الحيوية الجزيئية في جامعة سيدني بأستراليا، وسأعرض لكم اليوم تجربة لتحديد الملفات التعريفية للمستضدات السطحية في أنسجة سرطان القولون والمستقيم. باستخدام مصفوفة أجسام مضادة من نوع dot scan وتعدد الإرسال الفلوري، تتيح مصفوفات dot scan تحديد الملفات التعريفية لحوالي 140 مستضداً سطحياً على خلايا السرطان الحية مع الكريات البيضاء الالتهابية المرتبطة بها.

يمكن تمييز المجموعات الفرعية من الخلايا التي يتم التقاطها على المصفوفات الدقيقة باستخدام أجسام مضادة مُوسومة فلوريسنتياً ترتبط بمستضد علامة عالي التعبير على الخلايا المستهدفة. ويمكن تحليل ما يصل إلى ثلاث مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا على مصفوفة دقيقة واحدة باستخدام وسوم فلورية مناسبة على أجسام مضادة ذات ثلاث خصوصيات مختلفة. وتعد طريقة فحص مصفوفة DOT scan طريقة بسيطة نسبياً، وقد استُخدمت بالفعل في تحليل ملفات تعريف سطح الخلية لعدة أنواع من السرطانات.

تتمثل السمة الرئيسية للفحص بالتصوير المقطعي البصري الانتشارى (DOT scan) في قدرته على التقاط الخلايا الحية عبر مستضداتها السطحية، لذا فإن نمط الارتباط الذي نحصل عليه يعكس المظهر السطحي للخلية. تلعب المستضدات السطحية دوراً هاماً في تطور الأورام وانتقالها، وكذلك في الاستجابة الالتهابية لمحاربة السرطان. ويمكن استخدام الملامح السطحية الواسعة أو الأنماط الظاهرية المناعية كبصمات للمرض لتحسين تصنيف السرطان، مما يتيح تقديم العلاج الأمثل بعد الجراحة.

حسناً، لنبدأ. في التجربة الموضحة هنا، يتم جمع عينات سريرية من أورام سرطان القولون والمستقيم، من الدرجات A إلى D، في محلول "هانكس" المنظم (Hank's buffer). وللبدء، يتم تقطيع الورم بعناية باستخدام مشرطين إلى شرائح رقيقة بسمك 1 mm.

ضع الشرائح في محلول كولاجيناز من النوع الرابع بتركيز 2% ومحلول DNA بتركيز 10% لغرض الهضم. يتم جمع مقاطع من المخاطية المعوية الطبيعية من المريض نفسه على بعد 10 سنتيمترات من موقع الورم الأولي. وتعمل هذه المقاطع كعينة ضابطة، وتتم معالجتها بنفس طريقة معالجة عينة الورم.

تتم عملية هضم الورم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتعزيز تكسير النسيج الضام، حيث يقوم Dnase بتنظيف الحمض النووي DNA من أي خلايا تالفة. بعد الحضن، يتم تمرير معلق النسيج عبر مصفاة سلكية مع غسل العينة باستخدام محلول Hanks buffer، بينما يُستخدم مكبس حقنة سعة 10 mil للمساعدة في دفع الخلايا عبر المصفاة السلكية. وتُكرر هذه العملية عدة مرات حتى تمر معظم الخلايا عبر المصفاة السلكية.

تعمل الشبكة على فصل الخلايا عن أي أنسجة ضامة غير مهضومة. بعد ذلك، قم بترشيح معلق الخلايا بشكل إضافي عن طريق سحبه في سرنجة سعة 10 mL وترشيحه عبر مرشح fcon بمسامية 200 micrometer، يليه مرشح fil con بمسامية 50 micrometer. تضمن هذه المرشحات الأكثر دقة إزالة المخاط الزائد أو DNA، بالإضافة إلى تفكيك التجمعات الخلوية للحصول على معلق خلايا مفردة قابل للحياة.

تُجرى المعالجة نفسها على المخاطية الطبيعية. وقد وجدنا أن المخاطية الطبيعية تميل إلى احتواء المزيد من الأنسجة الضامة، ونتيجة لذلك، تتطلب المزيد من عمليات الغسل قبل الانتقال إلى مرحلة التعليق الخلوي باستخدام جهاز الطرد المركزي الشبكي بسرعة 410 G عند 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. وتحضيراً للتخزين المبرد، نقوم بتعليق الراسب الخلوي باستخدام 750 µL من مصل عجل جنيني، يليه أحجام متساوية من مصل عجل جنيني مع DMS.

أضف المحلول تدريجيًا مع الخلط المستمر. انقل جزءًا من السائل الطافي إلى أنبوب تبريد عميق (cryo tube) وضعه في حاوية عازلة. يمكن تخزين هذه العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد.

يجب أن يضمن العزل وDMSO تحرر الخلايا ببطء دون أن تنفجر. ومن الآثار الجانبية للتخزين تحلل مجموعة خلايا الدم الحمراء، ولكن لحسن الحظ، فإننا لسنا بحاجة إليها.

لإجراء التجربة، أخرج العينات من وحدة التخزين وقم بإذابتها سريعاً. في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C، أعد تعليق المعلق الخلوي في 10 mL من منظم Hank's، حيث يعمل المنظم على تخفيف 10% DMSO ومصل العجل الجنيني، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق عند 410 ×g في درجة حرارة 20 °C.

بعد ذلك، قم بتصريف السائل العلوي وإعادة تعليق الراسب في 500 µL من منظم هانك (Hank's buffer)؛ قد تتعرض بعض الخلايا للتلف أثناء عملية التجميد والإذابة مما يؤدي إلى إطلاق DNA في المعلق. ولمعالجة هذه المشكلة، قم بتحضين العينة مع 0.1% DNAs في درجة حرارة الغرفة. وخلال هذه الفترة، يمكن إجراء عد لحيويّة الخلايا.

امزج كميات متساوية من صبغة تريام الزرقاء (triam blue) مع 10 µL من معلق الخلايا، ثم انقل بواسطة الماصة 10 µL من الخليط إلى جهاز عد الخلايا. تحت المجهر، تظهر الخلايا السليمة والحية شفافة، بينما تظهر الخلايا غير الحية التي تمزقت أغشيتها باللون الأزرق.

يلزم توفر 4 ملايين خلية حيوية كحد أدنى لالتقاط الخلايا على مسح الأجسام المضادة DOT scan. MICRORAY falling. تم غسل الخلايا المualجة بالحمض النووي DNA مرة ثانية باستخدام 10 mls من منظم هانك (Hank's buffer) ثم تم إجراء الطرد المركزي عند 410 G لمدة خمس دقائق ودرجة حرارة 20 درجة مئوية.

نقوم بتعليق كتلة الخلايا النهائية باستخدام 200 µL من وسط RPMI. يحتوي هذا الوسط على مغذيات أكثر نسبياً من محلول Hanks المنظم، ويُستخدم لتسهيل التقاط الخلايا على مصفوفة الأجسام المضادة الدقيقة مع الحفاظ على حيوية الخلايا. تتكون مصفوفة الأجسام المضادة الدقيقة للفحص النقطي لسرطان القولون والمستقيم من 140 نقطة مختلفة من الأجسام المضادة مكررة على غشاء النيتروسليلوز.

تحتوي كل نقطة على المصفوفة على 10 نانولتر من جسم مضاد أحادي النسيلة ضد مستضد سطح الخلية. ولتحضير مصفوفة الأجسام المضادة الدقيقة، يتم غمسها في حوض من PBS لترطيب النيتروسليلوز، ثم تُمسح الحافة الزجاجية للمصفوفة باستخدام مناديل Kim، مع الحرص على عدم لمس قسم النيتروسليلوز، ثم توضع المصفوفة الدقيقة في حوض ويُنقل معلق الخلايا بواسطة الماصة فوق النيتروسليلوز.

سيضمن التوزيع المتساوي لمعلق الخلايا قدرة جميع الأجسام المضادة على التقاط الخلايا. يتم تحضين المصفوفة الدقيقة عند 37 degrees Celsius لمدة ساعة واحدة. وأثناء التحضين، ستنجرف الخلايا المختلفة إلى الأسفل وتتلامس مع الأجسام المضادة الموجودة على خلايا المصفوفة.

ستقوم المستضدات السطحية المعروضة والمقابلة للأجسام المضادة بربط واقتناص الخلية بعد فترة الحضن. يتم غسل الخلايا غير المرتبطة عن طريق غمس المصفوفات بلطف في ثلاثة تغييرات من محلول PPS الطازج. يتم تثبيت الخلايا المرتدة في محلول PPS وبنسبة 10% من الارتفاع الخارجي.

قم بنقل كمية وافرة من المثبت بعناية باستخدام الماصة لتغطية مقطع تحميل الخلية النيتروزيلوزية. اترك العينة للتحضين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغمس المصفوفات الدقيقة ثلاث مرات في محلول PBS طازج.

اترك المصفوفات في PBS للنقع لمدة 30 ثانية في كل غسلة، حيث يمكن أن يتداخل الارتفاع الزائد للمادة المكونة مع تعدد الإرسال الفلوري. يمكننا الآن التحقق من وجود ارتباط خلوي عن طريق وضع المصفوفة الدقيقة تحت الضوء لإجراء تحليل أكثر دقة. يتيح لنا ماسح DOT scan وبرنامج التحليل الخاص به مسح نمط الارتباط واستخراج نتائج كمية للتعبير عن المستضد في مجموعة خلايا مختلطة.

يقوم البرنامج بمقارنة كثافة ارتباط الخلايا مقابل ضوضاء الخلفية على مقياس تدرج ثماني البتات. وتتم معايرة وحدات الكثافة إلى قيمة قصوى تبلغ 256. ولتسهيل المقارنة بين مصفوفة ما، يتم خصم أي ارتباط إيجابي لضابط من النوع المتجمد (ice type control) من الأجسام المضادة ذات النمط الجزيئي المناعي (IG isotypes) المقابل.

أضف 200 µL من محلول الحجب (blocking buffer) إلى المصفوفة الدقيقة (microarray) واتركها لتحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وتحضيراً للتعدد الإشعاعي الفلوري (fluorescence multiplexing)، أضف 10 µL من CD3 المقترن بـ fiery و20 µL من epam المقترن بـ Alexa إلى 118 µL من محلول الحجب. بالإضافة إلى ذلك، يتم إضافة 2 µL من المصل المثبط حرارياً (heat inactivated serum) إلى الخليط لمنع الارتباط غير النوعي.

بمجرد اكتمال عملية الحجب، يتم استبدال محلول الحجب بمحلول التعدد الإرسالي ويُحضن في الظلام لمدة 30 دقيقة. وفي درجة حرارة الغرفة أثناء التحضين، سترتبط الأجسام المضادة المقترنة بـ CD three بالخلايا التائية التي تعبر عن CD three والمرتبطة بالمصفوفة، بينما سيرتبط الجسم المضاد المقترن بـ EPAM بالخلايا الظهارية أو خلايا سرطان القولون والمستقيم الموجودة على المصفوفة. بعد ذلك، تُغسل المصفوفة الدقيقة ثلاث مرات بمحلول PBS طازج، وتُترك لتجف في الظلام قبل إجراء المسح الضوئي للفلورة.

يتم الكشف عن التألق باستخدام ماسح Typhoon FLA 9,000. ويُمسح ملف FICO ery باستخدام ليزر بطول موجي 532 nanometer ومرشح انبعاث 580 BP 30، بينما يُمسح Alexa 647 باستخدام ليزر بطول موجي 633 nanometer ومرشح انبعاث 670 BP 30. ثم يتم تحويل الصور الفلورية الناتجة إلى صيغة tif للتحليل.

باستخدام برنامج مسح DOT. يسمح التعدد الفلوري لنا بتمييز ملفات المستضدات لمجموعات خلوية مختلفة ضمن نفس عينة النسيج. الصور المعروضة هنا مأخوذة من عينة لسرطان القولون والمستقيم.

هذه الصور الثلاث هي لمسح بصري، ومسح فلوري للخلايا التي تعبر عن CD3، ومسح فلوري للخلايا التي تعبر عن EPAM. يجب أن تظهر نتائج مسح DOT microray أنماط ارتباط خلوية متسقة بين الشريحتين المكررتين. ويشير الارتباط النقطي المكثف على طول حافة الشريحة إلى أنه تم التقاط كميات كافية من الخلايا.

يمكن إنشاء تقرير بصيغة PDF لتقديم قيم كمية لارتباط الخلايا. يوضح الرسم البياني الشريطي لتمثيل ارتباط الخلايا فرقاً في التعبير عن المستضد بين المخاطية الطبيعية وعينة الورم.

أعطت النتائج البصرية تمثيلاً عاماً للتعبير عن المستضدات في جميع أنواع الخلايا داخل العينة، بينما أظهرت نتائج تعدد الإرسال بتقنية AAM صورة أوضح للاختلاف في التعبير عن المستضدات بين الخلايا الظهارية الطبيعية والخلايا السرطانية. وبينما تُعرف العديد من المستضدات ذات التعبير المتباين كمجموعة من المؤشرات الحيوية لسرطان القولون والمستقيم، فإنها توفر بصمة مرضية أكثر دقة للتصنيف الطبقي مما يمكن أن يحققه أي مؤشر حيوي منفرد. وأظهرت نتائج تعدد الإرسال لـ CD3 وجود المزيد من الخلايا التائية في العينة السرطانية مقارنة بالعينة الطبيعية.

غالباً ما تعبر الخلايا التائية السرطانية عن علامات التنشيط، مما يشير إلى احتمال أن تكون هذه الخلايا التائية عبارة عن ليمفاويات متسللة إلى الورم أو خلايا تائية مرتبطة بالالتهاب. ويمكن إجراء تحليل واسع النطاق باستخدام multi experiment viewer الإصدار 4.4، وهو برنامج مفتوح المصدر لإنشاء الخرائط الحرارية وتحليل البيانات. كما يمكن استخدام التجميع الهرمي لعينات سرطان القولون والمستقيم لربطها بمرحلة المرض أو مآل المريض.

تُعد مكتبة بصمات الأمراض الشاملة أداة قيمة في التنبؤ بإنذار المرضى المصابين بسرطان القولون والمستقيم أو في تحديد مسار العلاج بعد الجراحة. لقد عرضنا لكم للتو إجراءً لتحليل تعبير المستضدات السطحية في مجموعة خلايا مختلطة من أنسجة سرطان القولون والمستقيم باستخدام مصفوفة الأجسام المضادة DOT scan والفلورة المتعددة. ومن الجوانب المهمة التي يجب تذكرها في هذه التجربة هي ضرورة استخدام أنسجة طازجة دائمًا، مع اشتراط وجود 4 ملايين خلية حية على الأقل لضمان نجاح هذه التجربة. نشكركم على مشاهدة هذا الفيديو ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.