كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

يوصف لفحص لقياس كميا تحويل عامل النمو (TGF) - β بفعل الغزو في المواد الهلامية الكولاجين 3 الأبعاد. هذا الاختبار يستفيد من سلسلة MCF10A من خطوط الخلايا التي تمثل مراحل مختلفة من تطور مرض السرطان الثدي. ويمكن اعتماد هذه الطريقة ليتم استخدامها مع خطوط الخلايا الأخرى ، ويمكن استخدامها لتفعيل التحقيق المحتملين الآخرين أو مثبطات الغزو.

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام مقياس لتأثير المنظمين المحتملين للغزو الناجم عن TGF beta في بيئة ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق صنع كرويات للخلايا أولا. ثم يتم تضمين PHE في الكولاجين ، مما يوفر بيئة ثلاثية الأبعاد.

بعد ذلك ، يتم تحديد المنطقة الغازية. من أجل تحديد تأثير العلاج على الغزو الناجم عن TGF بيتا ، تظهر النتائج أن معدلات مسار TGF-beta تؤثر على الخاصية الغازية للمنشطات في مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل مقال الخدش ، هي أنها تلخص بشكل أفضل البيئة ثلاثية الأبعاد.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقول مقياس T ، مثل تحديد الجينات الجديدة المشاركة في غزو بيتا الناجم عن المعلم. لتحضير محلول خلايا الميثيل لمقايسة الغزو المستحث TGF beta ، ابدأ بتعقيم ستة جرامات من ميثيل السليلوز في زجاجة سعة 500 مل تحتوي على تحريك مغناطيسي. قم بإذابة ميثيل السليلوز في 250 مل من D-M-E-M-F 12 المسخن مسبقا بدون مصل لمدة 20 دقيقة ، أضف 250 مل من درجة حرارة الغرفة D-M-E-M-F 12 يحتوي على 10٪ مزيج مصل الحصان طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي ، وقم بتنظيف المحلول عن طريق الطرد المركزي عند 5 ، 000 جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية.

انقل المحلول الشفاف عالي اللزوجة إلى مخزن أنبوب جديد عند أربع درجات مئوية حتى يستخدم لزراعة الأحوال. قم بإعداد محلول خلية ميثيل بنسبة 20٪ باستخدام 10 ملليلتر من مخزون خلايا الميثيل المحضر و 40 مل من النمو. غسل متوسط MCF 10 خلايا A مرتين باستخدام PBS.

أضف 0.1٪ تريبسين واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل جميع الخلايا. أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر ، وسط النمو ، وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. تحضير معلق من 10 ، 000 خلية لكل مليلتر في 20٪ خلية ميثيل.

لكل حالة اختبار ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 12 بئرا من لوحة تعليق سفلية مستديرة 96 جيدا. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي تحقق من تكوين كروي.

ستكون الكرات جاهزة للاستخدام في غضون يوم إلى ثلاثة أيام. قم بإعداد محلول على الجليد من ثمانية ملليلتر من الكولاجين ، ومليلتر واحد من 10 XPBS ، ومليلتر واحد من 0.1 هيدروكسيد الصوديوم العادي ، وثلاث قطرات من 0.1 حمض الهيدروكلوريك العادي. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول هو 7.4 عن طريق اكتشافه على شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني.

اضبط الرقم الهيدروجيني إذا كان خارج النطاق. أضف 50 ميكرولترا من محلول الكولاجين المحايد إلى آبار 96 Well، واحتضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة أو حتى يتجمد الكولاجين. لكل رابط يتم اختباره ، قم بإعداد محلول ترابط كولاجين خلية الميثيل على الجليد.

ابدأ بملليلتر واحد من محلول الكولاجين لكل علاج ، وأضف 20 نانوغراما من TGF beta للحصول على تركيز نهائي يبلغ خمسة نانوغرام لكل مليلتر ممزوجا بالدوامة. ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول خلايا الميثيل للحصول على حجم نهائي يبلغ ملليلترين ودوامة. مرة أخرى لتضمين الستيرويد ، ضع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، والذي كان يحتوي على خمسة ملليمترات أو أكثر من الطرف مقطوعا على ماصة سعة 200 ميكرولتر.

ثم خذ كرة واحدة مع الماصة. قم بتوزيع الوسط بحذر في طبق فارغ مع التأكد من بقاء الكروية S داخل الحافة. لا تحرر المكبس.

خذ 100 ميكرولتر من خليط خلايا ميثيل الكولاجين وقم بتوزيع خليط الكولاجين الكروي S في بئر مغلف بالكولاجين من 96. تملأ لوحة البئر 12 بئرا لكل حالة. دع الكولاجين يتجمد لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية وقم بإزالة فقاعات الهواء بطرف 200 ميكرولتر.

قم بإعداد محلول 40 ميكرومولار من مثبط بيتا TGF SB 4 31 542 عن طريق إضافة أربعة ميكرولتر من محلول مخزون SB 4 31 542 إلى مليلتر واحد من D-M-E-M-F 12 يحتوي على 1.6٪ مصل حصان. أضف 50 ميكرولترا من الوسط مع مثبط إلى كل بئر بعد الانتشار. سيكون التركيز النهائي للمثبط 10 ميكرومولار.

التقط صورا للستيرويد تحت المجهر باستخدام تكبير 40 × ، ثم احتضانه في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد حضانة لمدة يومين ، التقط صورا مرة أخرى وقم بقياس مساحة الستيرويد الغازي عن طريق فتح صورة كروية في Adobe Photoshop. قم بتوسيع أداة التحديد السريع وحددها.

سيتغير مؤشر الماوس إلى دائرة بعلامة زائد أثناء سحب المؤشر فوق الكروي. سوف يتعرف البرنامج على حدود الكروية. إذا تم تحديد منطقة خارج الستيرويد ، فقم باستبعاد المنطقة بالضغط على المفتاح البديل أو باستخدام أداة التحديد السلبية ، وهي علامة سلبية في شريط الأدوات.

اسحب المؤشر فوق المنطقة المحددة بشكل خاطئ وسيقوم البرنامج بإزالته من التحديد. إذا تم إلغاء تحديد منطقة داخل الكروي، فيمكن تضمين المنطقة مرة أخرى عن طريق السحب أثناء الضغط على شريط الإزاحة. للعمل بشكل أكثر دقة، اضبط حجم مؤشر الماوس عن طريق تغيير قطر الفرشاة في شريط الأدوات.

لحساب مساحة جميع التحديدات النشطة، اختر قياس التحليل في شريط القائمة. ستظهر نافذة تسجيل قياس توضح اسم الملف ومنطقة التحديد بالبكسل. إذا تم قياس تحديدات متعددة داخل كروي واحد ، فسيظهر السطر الأول مجموع جميع المناطق والخطوط أدناه.

سيسرد قيم التحديدات الفردية. قم بتصدير البيانات إلى ملف نصي وافتحه في Excel. مثال على الاختبار الكروي S مع MCF 10 A واحد ، الخلايا الظهارية الطبيعية للثدي ، HAS حول MCF 10 A الخلايا التائية الجديدة و M اثنين من MCF 10 CA واحد A موضح هنا.

أظهرت خلايا M1 غزوا ضعيفا فقط بدون تحفيز ، لكنها غزت بشكل أفضل بشكل ملحوظ بعد التحفيز بواسطة TGF beta. في المقابل ، قامت RAs بتحويل M1 مشتق M اثنين غزوا بكفاءة دون إضافة محفزات ، وزاد هذا من أربعة إلى خمسة أضعاف. بعد العلاج التجريبي TGF ، أظهرت الخلايا الأربع M أقوى غزو بدون وباستخدام TGF Beta Edition.

تم الحصول على تمثيل رسومي لنتائج هذه التجربة باستخدام Photoshop ويظهر هنا في هذا المثال ، SB 4 31 5 42 A TP التناظري والمثبط الانتقائي لنشاط كيناز مستقبلات TGF بيتا واحد ، وكذلك نشط في مستقبلات B من النوع الأول ونشط في مستقبلات مثل كيناز سبعة تمت إضافته إلى مزارع الخلايا SB 4 31 5 42 ، تثبيط قوي ، الغزو الناجم عن TGF beta لأربع خلايا M1 و M اثنان و M ، مما يشير إلى أن الغزو الناجم عن TGF-beta يعتمد على مستقبلات TGF-beta على كيناز واحد. بالإضافة إلى ذلك ، تم منع الغزو القاعدي ل PHE بشدة. تم إنشاء تمثيل رسومي لنتائج هذه التجربة مرة أخرى باستخدام Photoshop ويتم عرضه هنا.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل عزل الحمض النووي الريبي أو عزل البروتين للإجابة على أسئلة إضافية مثل الجينات التي يتم التعبير عنها أو البروتينات التي يتم التعبير عنها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية العثور على معدلات جديدة للغزو الناجم عن تافيتا.