تحديد الأهداف من microRNAs الإنسان مع نظام الفحص LightSwitch Luciferase به مراسل 3'UTR - a يبني وmicroRNA مقلد في خلايا منتسب

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء ترانسفكشن مشترك (co-transfection) لبنى مراسل (reporter constructs) مع محاكٍ لـ micro RNA للتحقق من أهداف micro RNA المتوقعة في مناطق 3' UTR البشرية. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال وضع تصميم تجريبي يتضمن اختيار خط خلوي وتحديد محاكيات micro RNA، إلى جانب بنى مراسل Go Clone لـ 3' UTR التجريبية والضابطة. بعد ذلك، يتم استزراع الخلايا الملتصقة قبل حوالي 24 ساعة من عملية الترانسفكشن. الخطوة التالية من الإجراء هي إجراء ترانسفكشن مشترك لكل بنية مراسل Go Clone لـ 3' UTR تجريبية أو ضابطة مع محاكٍ لـ micro RNA أو ضابط غير مستهدف، يليه تحضين لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة. وفي الخطوة النهائية، يُضاف كاشف مقايسة لوسيفيراز (luciferase assay) "light switch" مباشرة إلى الخلايا والمزرعة، ثم تُقرأ الإشارة الضوئية (luminescent signal) باستخدام مقياس لومينومتر للأطباق (plate luminometer).

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح أي من المناطق غير المترجمة الثالثة (3' UTR) البشرية هي المستهدفة بجزيء micro RNA معين، وذلك من خلال قياس انخفاض إشارة اللوسيفيراز باستخدام تقنية مقايسة المراسل. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية للباحثين في مجال micro RNA لأنها توفر مقايسة وظيفية للتحقق من تفاعلات استهداف micro RNA للمناطق غير المترجمة الثالثة المتوقعة في الخلايا الحية. يبدأ التصميم التجريبي باختيار خط خلوي ملتصق مناسب وعالي القابلية للترانزفكشن؛ حيث تعمل المقايسات القائمة على محاكيات micro RNA بشكل أفضل في الخطوط الخلوية ذات مستويات التعبير الداخلي المنخفضة لـ micro RNA.

بعد ذلك، اختر الزوج المكون من محاكي micro RNA وعنصر التحكم غير المستهدف؛ حيث يُعد تضمين عنصر تحكم غير مستهدف أمرًا بالغ الأهمية لأن عملية نقل البلازميد وأوليغو RNA صغير معًا تؤدي إلى إشارة أقل مقارنة بنقل البلازميد وحده. بعد ذلك، اختر تركيبات مراسل Go Clone لـ three prime UTR مسبقة الاستنساخ من مجموعة switchgears الشاملة للجينوم. انتقل إلى الكتالوج عبر الإنترنت وانقر على زر بحث UTR.

بعد إدخال قائمة أسماء الجينات، أو رموز الجينات، أو أرقام الوصول، ستوفر نتيجة البحث معلومات عن الناقل والتسلسل بالإضافة إلى حالة المخزون. الآن، قم باختيار بنى المراسل الضابطة. اختر بنى ضابطة ذات تسلسلات 3' UTR من غير المرجح أن تكون مستهدفة بواسطة micro RNA المختار، مثل تسلسلات التدبير المنزلي (housekeeping)، أو تسلسلات UTR، أو شظايا عشوائية، وذلك للضبط ضد التأثيرات غير النوعية للإفراط في تعبير micro RNA على الصحة العامة للخلية أو إشارة المقايسة.

يُنصح أيضاً باستخدام مراسل مستهدف لـ micro RNA اصطناعي كضابط موجب لنشاط المحاكي في اليوم الأول؛ حيث يتم استزراع خلايا ملتصقة من ممر منخفض، بحيث تصل درجة تلاقيها إلى 80 إلى 100% عند إجراء عملية عفن الخلية (transfection) بعد 24 ساعة. ويعد استخدام خلايا عالية التلاقي أمراً أساسياً لتحقيق نتائج جيدة. يتم استزراع الخلايا في طبق زراعة أنسجة أبيض مكون من 96 بئراً في حجم إجمالي قدره 100 µL.

بالتوازي، تحقق من وصول عدد الخلايا المناسب في طبق شفاف إلى حالة الالتحام الكامل في اليوم 2، أي بعد مرور 24 ساعة من استزراع الخلايا. استعد لعملية إذابة مواد عفن الخلية (transfection).

قم بإذابة بنى المراسل (reporter constructs) والميكرو آر إن إيه (micro RNAs) في درجة حرارة الغرفة. وبمجرد ذوبانها، اخلطها جيداً ثم خفف الميكرو آر إن إيه إلى تركيز عمل يبلغ 2 µM في ماء خالٍ من الـ RNAs. يتم توفير الـ plasma DNA بتركيز 30 ng/µL ولا يتطلب مزيداً من التخفيف. لتحضير خليط عفن الخلايا (transfection mixture)، ضع في اعتبارك وجوب إجراء عملية العفن لكل تركيبة DNA-RNA في ثلاث مكررات، كما يجب ضبط الحجم ليتناسب مع عدد المقايسات التي سيتم إجراؤها.

قم بتحضير خليط كاشف عفن الخلية (transfection reagent) عن طريق دمج 9.85 µL من الوسط الخالي من المصل مع 0.15 µL من Dharma effect DUO لكل عملية عفن. اترك الخليط ليتخضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بتحضير خليط D-N-A-R-N-A لكل مقايسة من خلال دمج 3.33 µL من بنية مراسل go clone مع كمية كافية من محاكي micro RNA لتحقيق التركيز النهائي المطلوب.

أكمل الحجم إلى 10 µL باستخدام وسط خالٍ من المصل. بعد ذلك، اخلط 10 µL من مزيج كاشف عفن الخلية (transfection reagent) مع 10 µL من كل مزيج D-N-A-R-N-A وامزجهما جيداً. يكون الحجم النهائي لكل مقايسة 20 µL.

قم بتغطية الآبار جيداً وتحضينها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد التحضين، أضف 80 µL من الوسط الغذائي الكامل الخالي من المضادات الحيوية والمسخن مسبقاً، ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 µL لكل بئر في المقايسة، مما ينتج عنه تركيزات نهائية من المقلد (mimic) تتراوح بين 10 و15 nM.

كخطوة نهائية، قم بإزالة الوسط بعناية من كل بئر من آبار الخلايا المزروعة، واستبدله بـ 100 µL من خليط التعدي النهائي المناسب. أعد الطبق إلى الحاضنة واتركه لمدة تتراوح بين 24 إلى 48 ساعة. ستعطي معظم الخلائط نتائج ملحوظة خلال 24 ساعة.

ستؤدي فترة تحضين لمدة 48 ساعة إلى زيادة التباين في الإشارة بين الآبار. في اليوم الثالث، أي بعد 24 ساعة من عملية ترانسفكشن، تُجرى مقايسات اللوسيفيريز باستخدام كواشف مقايسة light switch luciferase؛ حيث يمكن إجراء المقايسة للخلايا فوراً أو تجميدها عند درجة حرارة -80 °C ومقايستها لاحقاً. سيؤدي إدراج دورة التجميد والإذابة إلى تعزيز تحلل الخلايا وزيادة إشارة المراسل. تُترك لوحة الخلايا التي خضعت لعملية الترانسفكشن حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول مقايسة لوسيفيريز Light switch وفقًا لتعليمات المجموعة واسكبه في خزان معقم. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 µL من محلول مقايسة Light switch مباشرة إلى كل بئر في طبق الـ 96 بئر الأبيض، ثم غطِّ الطبق لحمايته من الضوء واتركه ليتحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد عملية التحضين.

اقرأ كل بئر لمدة ثانيتين باستخدام مقياس لومينومتر الصفائح. تم قياس تثبيط نشاط مراسل لوسيفيريز (Luciferase) لمنطقة 3' UTR بواسطة let-7a في خلايا HT 1080 عن طريق التحول المشترك (cotransfecting) لكل بناء مراسل مع محاكي let-7a أو ضابط غير مستهدف لتحليل النتائج. اعتبر الإشارة الناتجة عن الضابط غير المستهدف بنسبة 100% لكل بناء.

احسب نسبة التثبيط (knockdown) عن طريق قسمة الإشارة الناتجة عن محاكي micro RNA المحدد على إشارة التحكم غير المستهدفة. قد يكون لأي محاكي micro RNA تأثيرات غير محددة على الحيوية العامة للخلايا أو على إشارة المقايسة، لذا يجب التصحيح لمراعاة أي تأثيرات غير محددة. قارن التثبيط الملاحظ مع هدف UTR تجريبي بالتثبيط الملاحظ مع تحكم عشوائي أو تحكم في الجينات التدبيرية (housekeeping) كما هو موضح هنا.

تُعد PONC وarid three B من أهداف micro RNA let seven A البشري في المنطقة غير المترجمة 3' (three prime UTR). تنخفض إشارات مراسل المنطقة غير المترجمة 3' البشرية لجينات PUNC وarid three B بشكل ملحوظ في وجود محاكي micro RNA let seven A، بينما لا تنخفض الإشارات الخاصة بمراسل الجينات المرجعية (housekeeping) أو التسلسلات العشوائية للمنطقة غير المترجمة (URSs). بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد عملية ترانسفكشن مشتركة (cotransfection) ناجحة لمحاكيات microRNA وبناءات مراسل المنطقة غير المترجمة 3' في الخلايا الحية، وكيفية قراءة الإشارة باستخدام مقياس اللمعان (luminometer) لقياس انخفاض الإشارة.