مقدمة لالدبابير الطفيلية من ذبابة الفاكهة والاستجابة المناعية Antiparasite

تتمثل الأهداف العامة لهذا الإجراء في إظهار كيفية الحفاظ على مزارع الدبابير الطفيلية على ذبابة الفاكهة المضيفات وكيفية تشريح الغدة الليمفاوية والجسم الدهني. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الدبابير الأولى على يرقات ذبابة الفاكهة. ثم يتم تشريح لعزل الغدد الليمفاوية اليرقة ، والتي تتضمن تقشير البشرة وإزالة الأجسام الدهنية وغيرها من الهياكل الدقيقة لعزل الغدد الليمفاوية.

وبالمثل ، يمكن عزل الأجسام الدهنية نفسها باستخدام إجراء مماثل باستخدام كيمياء السيتو المناعية والفحص المجهري الفلوري. يتم تصور التعبير الجيني والتغيرات الخاصة بالخلايا في الأنسجة المناعية. بعد غزو الدبابير ، ندرس نظاما فريدا من العدوى والمناعة يستخدم ذبابة الفاكهة خرطوم ودبورها الطفيلي.

مختبرنا هو واحد من العدد القليل من المختبرات التي يتم فيها الحفاظ على ثقافات الحياة لذبابة الفاكهة الطفيليات. وبالتالي ، غالبا ما يطلب منا مشاركة تقنياتنا. الطفيليات هي أعداء طبيعيون للعديد من الحشرات.

تهاجم الأنواع التي ندرسها مراحل اليرقات للعديد من أنواع ذبابة الفاكهة. في المختبر ، نستخدم ذبابة الفاكهة ميلان المعدية لفهم كيفية تأثر الجهاز المناعي للحشرات بمهاجمة الطفيليات. ثانيا ، نريد اكتشاف الاستراتيجيات التي تستخدمها wass للتغلب على دفاع المضيف.

بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد في تشريح الجسم الدهني والغدد الليمفاوية لأنه في حين أن يرقات الأوف سهلة النمو ، إلا أنها صغيرة الحجم إلى حد ما ، ويتطلب الأمر معرفة كبيرة لتشريح هذه الأعضاء اللافية بشكل روتيني بسهولة. بعد اكتشاف أن التنشيط التأسيسي لإشارات NF kappa B يؤدي إلى تغليف مناعي ذاتي مثل تغليف أنسجة الخلايا ، أصبحنا فضوليين بشأن كيفية حدوث هذا التفاعل في طفرات oph fla. لذلك افترضنا أن التغليف المستحث هو نظيره الطبيعي وتطوير هذه البروتوكولات القياسية التي سنعرضها اليوم ، سأوضح الآن كيفية تحضير مزارع الدبابير والحفاظ عليها.

ابدأ بتحضير قارورة طعام ذبابة طازجة مع القليل من معجون الخميرة الطازج. انقل 50 إلى 60 ذبابة برية صغيرة إلى القارورة لوضع البيض لمدة 48 ساعة عند 24 درجة مئوية. بعد يومين من وضع البيض ، أخرج الذباب من القارورة وأضف قطرة من العسل إلى سدادة الطنانة.

وأخيرا ، قم بتلخيص القارورة. قلل من تدفق ثاني أكسيد الكربون قبل تخدير الدبابير لأنها أكثر حساسية للغاز من الذباب. بمجرد أن تصبح الدبابير جاهزة للتخدير ، قم بفرز ستة إلى ثماني دبابير من الإناث وستة إلى ثمانية ذكور الدبابير وإضافتها إلى القارورة.

مع ذبابة الفاكهة البيض واليرقات. ضع القارورة برفق على جانبها حتى تستيقظ الدبابير. ثم ضع القارورة في حاضنة 24 درجة مئوية.

المضيف والمضيفين غير المتأثرين الذين يدافعون عن أنفسهم بنجاح سوف يطلقون الجرو في النقطة الزمنية للتطوير العادي. يمكن إزالتها قبل انفجار الدبابير ه. عادة ما تغلق الدبابير بالتيار المتردد حوالي 25 إلى 30 يوما لتحضير الدبابير في نفس مرحلة التطور.

قم بتربية الدبابير ببيض المضيف الذي يوضع على مدى ساعتين إلى ست ساعات بدلا من 48 ساعة لحصاد اليرقات المصابة لتشريح الأنسجة المناعية أو الطفيليات. انقل محتويات قوارير الذباب إلى طبق بتري زجاجي أو بلاستيكي صغير. ثم باستخدام مجهر ستيريو والعثور على ملقط ، اختر بعناية ستة إلى 10 يرقات.

ضع اليرقات في بئر مع XPBS واحد أولا ، ثم انقلها إلى الماء و 70٪ من ماء الإيثانول و XPBS واحد على التوالي. الغرض من هذه الخطوات هو تحرير من طعام الذباب وتنظيف وتعقيم سطحها تماما. في مرحلة تشريح مجهر تشريح Zes 1000 ، ضع صندوقا ضوئيا يسمح بنقل الضوء الساقط عبر العينة.

باستخدام ملقط دقيق ، حدد يرقات الطور الثالث المتجولة النظيفة من PBS. ضع اليرقات على شريحة مجهرية. باستخدام الملقط ، ضع مع الجانب البطني لأعلى.

تبليط مصدر الضوء بعيدا عن العينة بحيث يبدو الكائن الحي شفافا وتكون الأعضاء الداخلية مرئية. أثناء نقل اليرقات إلى الشريحة ، فأنت تريد التأكد من عدم وجود PBS زائد لأن هذا قد يجعل القسم أكثر صعوبة في بعض الأحيان. باستخدام زوجين من الملقط ، أمسك على جانبي الطرف الخلفي واسحب البشرة برفق لإدخال تمزق سطحي صغير في البشرة.

سيبدأ الليمفاوية الدموية التي تحتوي على الأجسام الهضمية والدهون في الهروب من تجويف الجسم. يمكن تناول الهيموليمف مع رجل ماصة سعة 10 ميكرولتر لعمل مسحات إذا لزم الأمر ، ووضع كلا الملقطين على الجانب الأيسر من أسفل خطافات الفم بعناية. اصنع مسيلة للدموع اللطيفة في البشرة.

حرك كلا الملقطين على الجانب الأيمن من أسفل خطافات الفم مباشرة وقم بتمزق صغير آخر بعناية. الآن أثناء الإمساك بخطافات فم ، قم بتقشير البشرة برفق باتجاه الطرف الخلفي للحيوان. عندما يتم سحب بشرة للخلف ، ستتعرض الأقراص الخيالية للجسم الدهنية في الدماغ والغدد اللعابية والبطين المثبت.

تحتوي البشرة المنفصلة في الطرف الخلفي على الوعاء الظهري مع الغدة الليمفاوية المتصلة به. تقع الغدة الليمفاوية تحت الدماغ. قطع البطين المثبت ونقله بعيدا عن منطقة الغدة الليمفاوية.

قم بإزالة الدهون والجسم والأمعاء والغدد اللعابية والهياكل الأخرى من الغدة الليمفاوية بعناية. احرص على عدم فصل الغدة العرجاء عن الغدة الحلقية والوعاء الظهري الموجود خلف الدماغ. ضع الغدة الليمفاوية بشكل مسطح مقابل شريحة المجهر وقم بإزالة جميع الأنسجة الإضافية بعناية حتى تتكشف الغدة بأكملها من الفص الأمامي إلى المجموعة النهائية من خلايا التامور.

الغدة جاهزة الآن للإصلاح والتلطيخ في مرحلة تشريح مجهر تشريح Zes 1000. ضع صندوقا ضوئيا يسمح بنقل الضوء الساقط عبر العينة. ضع يرقة الطور الثالث النظيفة على المجهر.

انزلق 200 ميكرولتر من XPBS واحد. قم بإمالة مصدر الضوء بعيدا عن العينة بحيث يبدو الكائن الحي شفافا وتكون الأعضاء الداخلية مرئية. باستخدام الملقط ، ضع بحيث يكون الطرف الأمامي بعيدا عنك.

في الخطوة التالية ، من المهم ملاحظة المكان الذي تضع فيه الملقط للتأكد من تمزيق البشرة فقط دون لمس الأعضاء الداخلية. باستخدام زوج واحد من الملقط ، أمسك بشرة اليرقات على الجانب الأيسر من الفم ، وخطافات بالملقط الآخر. قم بتمزيق البشرة برفق على الجانب الآخر وصولا إلى النهاية الخلفية.

توقف قبل تمزيق بشرة بعيدا عن الجسم في الطرف الخلفي ، وابدأ برفق شديد في إزالة الأمعاء إلى جانب واحد. قم بإزالة الأقراص الخيالية في الدماغ والغدة الحلقية برفق مع الغدة الليمفاوية التي تمر عبر الوعاء الظهري. أخيرا ، قم بإزالة البشرة برفق على جانبي الجسم الدهني.

لا تقم بإزالة الغدد اللعابية نظرا لوجود أجسام دهنية على جانبي هذه الغدد. قبل الشروع في تثبيت وتلطيخ الأنسجة ، تأكد من إزالة PBS. يجب أن تحافظ عينة الجسم الدهنية المشرحة جيدا على ملامسات الخلايا الطبيعية ويجب أن تحتوي على الحد الأدنى من كريات الدهون حول العينة التي تم تشريحها.

يتم تصور تأثير الإصابة بالدبابير على التعبير الجيني في الجسم الحي. باستخدام مراسل GFP المرتبط بمحفز Theso Mycin في التحكم غير المصابة ، لم يتم اكتشاف تعبير GFP. في حين يتم اكتشاف إشارة GFP بوضوح في سيتوبلازم الأجسام الدهنية التي تم تشريحها من المصابة ب l فيكتوريا.

تم تشريح الغدد الليمفاوية لتصور التغيرات الخلوية التي تحدث في الفصوص الأمامية بعد عدوى إل فيكتوريا. تظهر الخلايا المتمايزة حديثا المميزة ب GFP مدفوعة بالمحسن المشوه في محيط الفصوص. عادة ، تحيط الغدد بالفص باستمرار.

ومع ذلك ، فقد تعطلت سلامة الفصوص الأمامية في هذه الغدد حيث كان الغشاء القاعدي متقطعا بعد إصابة الدبابير من نفس التشريح. تم تصور الخلايا في الهيموليمف في اللطاخات. انخرطت بعض الخلايا الليمفاوية في شكل كبسولة لمنع تطور الطفيليات للكشف عن تعبير بيتزل.

الغدد الليمفاوية التشريح. تم تلطيخ الغدد الليمفاوية بالأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة لشبيل في الجسم الحي. زادت مستويات Schpeil في خلايا الغدد الليمفاوية بعد الإصابة بالدبابير مقارنة بالضوابط غير المصابة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تحضير مزارع المريء في العمر البيولوجي المطلوب. عالجهم برفق حتى لا يؤدي التعامل اليدوي إلى ردود فعل مناعية. باتباع هذا الإجراء ، يمكننا استخدام الأعضاء المقطعة والجسم الدهني والغدة الليمفاوية لاستخراج الحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الحمض النووي الريبي أو البروتين المستخرج.

يمكننا إجراء تحليل PCR أو Westin لدراسة التعبير الجيني والبروتيني. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية النمو. كان الطفيلي على ذبابة الفاكهة المضيفين ويقوم بتشريح الأنسجة المناعية للكيمياء المناعية والتطبيقات الأخرى.