متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج بروتينات مأشوبة عالية النقاء من خلال إجراء تنقية بالتقارب يتكون من خطوتين. ولتحقيق ذلك، يتم استنساخ علامة تنقية ثنائية الخصوصية تعتمد على نطاق ربط الألبومين في ناقل تعبير يحتوي على الجين المستهدف، ويتبع ذلك التعبير عن البروتين الاندماجي في بكتيريا e coli. وفي الخطوة الثانية، يتم إخضاع المستخلص البكتيري الذي يحتوي على البروتين المستهدف للتنقية باستخدام عمود كروماتوغرافي يحتوي على ألبومين المصل البشري المثبت أو HSA.

يتبع ذلك عملية تنقية إضافية باستخدام عمود MAB select superior resistance أو sure يحتوي على نطاق Z مثبت والمشتق من البروتين A العنقودي. وينتج عن ذلك منتج عالي النقاوة مناسب للتطبيقات الدقيقة. بعد ذلك، يتم تقييم النقاوة عن طريق SDS page، وعند الضرورة، باستخدام مطياف الكتلة لضمان تنقية البروتين المستهدف بنجاح حتى الوصول إلى التجانس؛ وتظهر النتائج تنقية فعالة بعد خطوتين متتاليتين مقارنة بخطوة واحدة باستخدام علامة التنقية ثنائية التخصص المبتكرة المستخدمة في هذا البروتوكول. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التنقية بالالفة ذات الخطوة الواحدة، في إمكانية الحصول على بروتين نقي من خلال بروتوكول بسيط يستخدم مقبض ألفة واحدًا فقط بغض النظر عن خصائص البروتين المستهدف.

يمكن استخدام هذه الطريقة مع البروتينات ذات الخصائص المتنوعة للغاية. وبما أن الوسم صغير جداً، فإنه يُنتج بسهولة بواسطة المضيف البكتيري. وبوجه عام، سيجد الأشخاص الجدد في إجراء التنقية هذا أنه بسيط ومباشر للغاية.

تعد خطوة ضبط الرقم الهيدروجيني pH للعينة قبل تحميلها على العمود الثاني خطوة حاسمة. تم تطوير علامة تنقية صغيرة ذات ألفة مزدوجة مدمجة من خلال دمج موقع ارتباط إضافي في نطاق ارتباط الألبومين الموجود مسبقاً والمشتق من البروتين G لبكتيريا streptococcal. يطوي نطاق ارتباط الألبومين المكون من 46 حمضاً أمينياً إلى حزمة ثلاثية الحلزونات مستقرة ويحتوي على موقع ارتباط لألبومين المصل البشري، يقع بشكل أساسي في الحلزون الثاني؛ ومن خلال العشوائية الجينية لـ 11 حمضاً أمينياً مكشوفة على السطح في الحلزونين الأول والثالث، تم تصميم أسطح ارتباط جديدة. وأدت عدة جولات من عملية biop panning ضد نطاق Z المشتق من البروتين A لبكتيريا staphylococcal، مع التعبير عن المكتبة التوليفية على العاثيات، إلى إنتاج جزيء ثنائي النوع يسمى A BDZ one يتمتع بألفة لكل من HSA ونطاق Z. ولتحضير بلازميد تعبير لعلامة الاندماج ثنائية النوع، يتم تحضير قطع PCR لجين A BDZ one محاطة بمواقع قطع مناسبة للدمج في نهاية الجين المستهدف في بلازميد التعبير؛ ثم تُقطع قطع PCR لـ A BDZ one وناقل التعبير المُنقى الذي يحتوي على الجين المراد دراسته باستخدام إنزيمات القطع المختارة في محلول منظم للتفاعل مناسب، وتُنقى النواتج قبل عملية الربط.

بعد ذلك، قم بربط قطعة A BDZ المقيدة في ناقل التعبير الذي يحتوي على الجين المستهدف، ثم قم بتحويل ناتج الربط إلى بكتيريا e coli. وزع الخلايا المحولة على أطباق الآجار المدعمة بالمضادات الحيوية المناسبة للاصطفاء. قم بإجراء فحص PCR لعدد قليل من المستعمرات، ثم تحقق من تسلسل كاسيت التعبير الناتج عن طريق تسلسل DNA.

أخيراً، قم بتحضير البلازميد من مزرعة ليلة واحدة لمستعمرة تم التحقق من تسلسلها، والتي تم تحويلها إلى سلالة التعبير المفضلة للتعبير عن البروتين المستهدف. مع دمج العلامة الجديدة في نهايات Termini، ابدأ بتلقيح مستعمرة بكتيرية واحدة في 10 milliliters من مرق الصويا التريبتيك (tryptychs soy broth) المكمل بخمسة جرامات لكل لتر من مستخلص الخميرة والمضادات الحيوية المناسبة، ثم قم بالتحضين عند 150 RPM و37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي، قم بتلقيح 1 milliliter من مزرعة الليل الواحدة في 100 milliliters من وسط نمو جديد، ثم قم بتحفيز التعبير البروتيني.

عندما تصل الخلايا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي. بعد تحفيز البروتين، تُحضن الخلايا بسرعة 150 RPM ودرجة حرارة 25 درجة Celsius طوال الليل، ثم تُجمع الخلايا في اليوم التالي عن طريق الطرد المركزي. يتم إجراء تنقية الألفة المتعامدة لبروتين الدمج A BDZ one من خلال تنقية أولية إما باستخدام عمود يحتوي على HSA مثبت أو zoma. بعد ذلك، يتم تنفيذ خطوة تنقية متتالية باستخدام الألفة الثانية للوسم ثنائي التحديد.

تتوفر الأوساط الكروماتوغرافية التي يتم تثبيت نطاق Z (Z domain) عليها، مثل MA select sure، بسهولة لتنقية الأجسام المضادة. وفي المقابل، يمكن ربط HSA كيميائياً بالأوساط لتوفير المصفوفة الثانية للمضي قدماً في عملية تنقية الألفة المتعامدة (orthogonal affinity purification). أعد تعليق الراسب في 25 milliliters من محلول التشغيل المنظم. ثم قم بتفتيت الخلايا عن طريق الموجات فوق الصوتية (sonication) عند سعة 60% ونبضات مدتها ثانية واحدة، تليها وقفة لمدة ثانية واحدة، وذلك لمدة إجمالية تصل إلى ثلاث دقائق.

بعد طرد العينة مركزياً، قم بترشيح السائل الطافي الذي يحتوي على البروتين المستهدف عبر مرشح مسامي بحجم 0.45 micron قبل المتابعة في عملية التنقية. بعد ذلك، قم بموازنة عمود HSA spheros سعة 1 مل أو عمود NHS activated مقترن بـ HSA باستخدام 10 أحجام عمود من محلول التشغيل المنظم (running buffer) بمعدل تدفق 1 مل في الدقيقة باستخدام نظام مناسب لتنقية البروتين. وبمجرد إتمام الموازنة، قم بتحميل المستخلص البكتيري بمعدل 0.5 مل في الدقيقة، ثم أعِد ضبط معدل التدفق إلى 1 مل في الدقيقة واغسل العمود بخمسة أحجام عمود من محلول التشغيل المنظم، يتبعها خمسة أحجام عمود من محلول الغسيل المنظم (washing buffer).

قم بشطف العينة باستخدام محلول الشطف بمعدل 1 مل في الدقيقة واجمع الأجزاء. راقب الامتصاص عند 280 نانومتر لاختيار الأجزاء من القمة المستخلصة. لمزيد من التنقية، قم بتجميع الأجزاء ذات أعلى تركيز بروتيني، ثم خففها بمقدار ضعفين.

تأكد من استخدام محلول التوازن (running buffer) وتأكد أن الرقم الهيدروجيني (pH) يقارب التعادل. تعد هذه الخطوة حاسمة لارتباط البروتين بنطاق Z. أضف tris HCL بتركيز 1 M ورقم هيدروجيني pH 8 لرفع قيمة pH إذا لزم الأمر.

بعد ذلك، قم بتحميل العينة بمعدل 0.5 ملليلتر في الدقيقة على عمود حبس SureTrap MA بحجم واحد ملليلتر، والذي تم موازنته مسبقاً باستخدام منظم Sure running buffer. وبعد إعادة ضبط معدل التدفق إلى 1 ملليلتر في الدقيقة، يتم غسل العمود بخمسة أحجام من منظم Sure running buffer. ثم تُستخلص البروتينات باستخدام حمض الأسيتيك بتركيز 0.2 مولار ودرجة حموضة pH 2.7 بالنسبة للبروتينات المستهدفة الحساسة.

يمكن معادلة الـ EIT مباشرة عند الجمع عن طريق إضافة T tris. ويمكن استخدام صفحة H-C-L-S-D-S لتقييم نقاء البروتين. ومن المهم اختزال العينة بالكامل لأن وجود مجموعة cyte حرة في A BDZ one قد يؤدي إلى ديمرة المنتج في الظروف غير المختزلة.

كخطوة نهائية، يمكن تحليل الوزن الجزيئي للمنتج المنقى عن طريق مطيافية الكتلة بعد التنقية باستخدام البروتوكول المتعامد على عمود HSA، يليه عمود MA select sure. تم تحليل عينات مختلفة جُمِعت من نقاط تنقية متعددة باستخدام تقنية SDS page. شملت العينات وسم A BDZ one نفسه، بالإضافة إلى ثلاثة بروتينات مستهدفة بشرية مختلفة مدمجة مع AB DZ one، والتي تمثل فئات مختلفة من الذوبانية، والأوزان الجزيئية، ونقاط التعادل الكهربائي.

تظهر المسارات من واحد إلى أربعة نواتج تحلل البروتين قبل التنقية لثلاثة بروتينات دمج AB DZ one مختلفة ووسم AB DZ one نفسه. وتظهر المسارات من خمسة إلى ثمانية نتائج خطوة تنقية البروتينات باستخدام HSA. وأخيرًا، تظهر المسارات من تسعة إلى 12 نتائج خطوة التنقية النهائية باستخدام mAbs select Sure.

بالإضافة إلى ذلك، تم هنا تحليل عينات تم الحصول عليها من نفس المستخلصات التي نُقيت بترتيب عكسي على نفس الأعمدة. تظهر المسارات من واحد إلى ثلاثة المستخلصات قبل التنقية، بينما أُخذت المسارات من أربعة إلى ستة بعد خطوة التنقية الأولى على عمود MAB Select Sure. أما المنتجات عالية النقاء في المسارات من سبعة إلى تسعة فهي نتيجة للتنقية النهائية لبروتين HSA.

تظهر النتائج بوضوح فائدة استخدام الوسم المزدوج وخطوتي تنقية عاليّتي التخصص. وعلى الرغم من تحقيق درجة نقاء معقولة بعد خطوة التنقية الأولية كما يتضح من هلام الفصل الكهربائي، إلا أن الخطوة المتتالية تنتج منتجاً عالي النقاء ومناسباً جداً للتطبيقات ذات المتطلبات الدقيقة. وبمجرد إتقان خطوة التنقية المركزية في هذه الطريقة، يمكن لشخص واحد تنفيذها في غضون ساعات للحصول على بروتين مأشوب عالي النقاء يصلح للعديد من التطبيقات المختلفة.

على سبيل المثال، وباتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام الجزيئات الحيوية المنقاة في تطبيقات أخرى، مثل دراسات التفاعل من أجل الإجابة على تساؤلات مثل قوة ارتباط المعقد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد جداً لكيفية الحصول على منتج بروتيني نقي تماماً من خلال استخدام وسم الألفة المزدوج هذا.