الصلبة مرحلة تجميع Submonomer من البوليمرات Peptoid واحترامهن الجمعية ، في الارتحال التي تأمر Nanosheets

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف طريقة بسيطة وفعالة لتخليق الببتيد في الطور الصلب والتجميع الذاتي المائي للببتيدات في صفائح نانو عالية الترتيب. تشبه الببتيدات من الناحية الهيكلية عديد الببتيدات في بوليمرات الجلايسين البديلة حيث ترتبط السلاسل الجانبية بالنيتروجين بدلا من كربون ألفا. تبدأ العملية بتجميع تسلسل ببتيد معين عبر طريقة مونومر فرعي أخرى.

تتكون طريقة المونومر الفرعي من خطوتين كيميائيتين بسيطتين تدخلان كل مونومر في السلسلة بالتتابع. أولا ، يتم أسيتيل البرومو أمين المتصل بدعامة صلبة. ثانيا ، يتم إزاحة البروميد بأمين أولي.

تتكرر هذه الخطوات حتى يتم تحقيق طول السلسلة المطلوب بعد استطالة السلسلة ، يتم شق الببتيد من الدعم الصلب ويتم تنقية زيت الببتيد الخام الناتج بواسطة HPLC ويتميز ببدء التجميع الذاتي للببتيدات في صفائح النانو. يتم تحضير محلول عازل مائي مخفف للببتيد في قارورة زجاجية ويخلط برفق. كخطوة أخيرة.

يتم فحص صفائح النانو تحت المجهر. توضح النتائج أن الدورة التكرارية المكونة من خطوتين كيميائيتين بسيطتين يمكن أن تنتج بوليمر محدد بالتسلسل يتجمع تلقائيا في صفائح نانو. الببتيدات هي فئة جديدة من البوليمر المستوحى من الحيوية مع خصائص بين تلك الموجودة في البروتينات والبوليمرات التقليدية.

إنها قوية ومتعددة الاستخدامات صناعيا مثل البوليمرات التقليدية ، ولكنها أيضا قابلة للضبط بدرجة كبيرة ومحددة التسلسل مثل البروتينات وببتيدات الحمض النووي التي تظهر كمادة متقدمة لمعالجة المشكلات الرئيسية في الطب الحيوي وعلوم المواد ، مثل تحديد الأدوية النشطة بيولوجيا أو تصميم البروتينات الاصطناعية. تشمل المزايا الرئيسية للببتيدات التحكم الدقيق في التسلسل ، وتوافر اللبنات الأساسية المتنوعة بشكل لا يصدق ، والتوليف الفعال واستقرار البروتياز. تم تحديد طريقة التخليق اليدوي للببتيد العامة التي تتضمن المعدات الأساسية والكواشف المتاحة تجاريا مما يتيح تصنيع الببتيدات بسهولة في معظم المختبرات.

العرض المرئي للخطوات التركيبية أمرا بالغ الأهمية ويعمل كمرجع قيم للأفراد الذين يدخلون مجال تخليق الطور الصلب. لأول مرة هنا ، تم وصف تنقية وتوصيف الببتيد البرمائي 36 ميرس بالإضافة إلى تجميعه الذاتي في صفائح نانو مرتبة للغاية. ابدأ هذا البروتوكول بإعداد الجهاز التجريبي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

سيتم تنفيذ الخطوات التالية في وعاء تفاعل زجاجي بدلا من خرطوشة البولي بروبلين المزودة بفريت يمكن التخلص منها من أجل الوضوح. بعد الإعداد عند 100 ملليغرام من راتنج أميد R إلى وعاء تفاعل مزبوع ، انتفخ الراتنج عن طريق إضافة ملليلترين من أميد ثنائي ميثيل أو DMF ، قم بتحريكه عن طريق الفقاعات لمدة 10 دقائق. ثم قم بتصريف المحلول بالمكنسة الكهربائية لعزل الراتنج المنتفخ.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من 20٪ ميثيل بيريدين كامل في DMF لحماية مجموعة FM O. حرك لمدة دقيقتين ثم صفيه. كرر هذه العملية لمدة 12 دقيقة ، ثم اشطف الراتنج بإضافة ملليلترين من DMF مع التقليب لمدة 15 ثانية وتصريفه.

ابدأ في تنمية سلسلة الببتيد مع دورة المونومر الفرعية الأولى ، والتي تتضمن أستلة البرومو وخطوة الإزاحة. بالنسبة لأستيلة البرومو ، أضف ملليلتر واحدا من 0.6 مولار من حمض برومو الخليك في DMF و 86 ميكرولتر من سوس ثنائي الأيزوبروبيل كربو. بعد التقليب لمدة 30 دقيقة ، صفيها واشطفها بملليلترين من DMF.

بعد ذلك ، قم بإجراء الإزاحة عن طريق إضافة مليلتر واحد من أمين مولار واحد إلى اثنين من أمين المولار في نهاية احتضان ميثيل بايرو جينيون لمدة 30 إلى 120 دقيقة بعد الحضانة ، واستنزاف وشطف بملليلترين من DMF. مرة أخرى ، استمر في تنمية سلسلة الببتيد عن طريق تكرار دورة المونومر الفرعي. بعد الانتهاء من الإزاحة النهائية ، اشطفها بملليلترين من DMF.

اتبع ذلك بغطاء غسيل ديورا ميثان وقم بتخزين وعاء التفاعل حتى الانقسام. لبدء الانقسام ، انقل كل الراتنج المجفف إلى قارورة زجاجية متلألئة سعة 20 مليلتر تعمل داخل غطاء المحرك وباستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة ، أضف أربعة ملليلتر من حمض الخليك ثلاثي الفلورو ، أو كوكتيل الانقسام TFA إلى قارورة زجاجية ومغطية. يقلب بإحكام لمدة 10 دقائق إلى ساعتين من درجة حرارة الغرفة.

بدلا من ذلك ، استخدم شاكر دوار لخلط المحلول. اجمع محلول الانقسام TFA عن طريق تصفية الراتنج من خلال خرطوشة من مادة البولي بروبيلين المزودة بفريت يمكن التخلص منها في قارورة زجاجية جديدة متلألئة سعة 20 ملليلترا تزن مسبقا. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من كوكتيل الانقسام الطازج لشطف الراتنج وجمع أي ببتيد متبقي.

كرر هذا ، اشطفه مرتين. تبخر TFA عن طريق نفخ تيار لطيف من النيتروجين أو باستخدام شحنة حيوية. المبخر الأحمر V 10 يذوب الزيت الخام في ستة ملليلتر من واحد إلى واحد من نتريل الأسيتو والماء.

ثم قم بتجميد العينة وتجميدها. يجب تكرار هذه العملية مرة أخرى بعد التجميد الثاني. سجل وزن مخزن المنتجات الخام كمسحوق جاف عند 20 درجة مئوية تحت الصفر من خلال مزيج من HPLC التحليلي العفني و / أو الرش الكهربائي LCMS.

يمكن تحديد نقاء المنتج الخام وما إذا كان الوزن الجزيئي المطلوب موجودا باتباع الإجراءات الموضحة في النص. يمكن بعد ذلك تنقية خليط الببتيد الخام باستخدام HPLC الإعدادي للمرحلة العكسية وفقا للإجراء المكتوب. يصف هذا القسم البروتوكول لتشكيل أوراق من سلسلة واحدة سلسلة محددة البرمائية 36 أنا الببتيد.

بعد تصنيع خيط الببتيد وتنقيته وتجفيده بالتجميد ، يتم إذابة المسحوق الأبيض الناتج في DMSO لصنع محلول مخزون مللي مولار. بعد ذلك ، احصل على ملف Dr.Glass واحد لإعداد محلول ببتيد 20 ميكرومولار. أولا ، أضف 445 ميكرولترا من ماء مللي Q و 50 ميكرولترا من 10 × مخزن مؤقت لتكوين الورقة.

دوامة القارورة للخلط. ثم أضف خمسة ميكرولترات من محلول مخزون الببتيد المليمولار وانتفخ برفق. تتشكل صفائح المحلول الناتجة عن التحريك اللطيف لمحلول الببتيد المائي المخفف.

قم بإمالة القارورة الزجاجية المغطاة ببطء من الوضع الأفقي إلى الوضع الرأسي. ينتج عنه صفائح لطيفة يهتز ، كما ينتج عنه أوراق. ومع ذلك ، تميل الأوراق إلى أن تكون أصغر حجما وذات حواف مستقيمة أقل للعديد من الأوراق عالية الجودة.

قم بتدوير القوارير الزجاجية حول المحور الأفقي ببطء لمدة يوم واحد باستخدام دوار أنبوبي أو هزاز مخصص لتلوين صفائح النانو الفلورية ، أضف ميكرولتر واحد من 100 ميكرومولار نيل أحمر إلى 100 ميكرولتر من محلول صفائح النانو للحصول على تركيز نهائي من ميكرومولار نيل واحد. الأحمر هو صبغة حساسة بيئيا تزداد شدتها الفلورية عندما يتم توطينه في البيئات الكارهة للماء. بعد ذلك ، اصنع محلول 1٪ aros في الماء الساخن واسكبه في طبق بتري بلاستيكي.

تأكد من أن سمك محلول aros يبلغ حوالي ثمن البوصة واترك المحلول يبرد دون إزعاج على سطح مستو. بعد أن يتماسك aros ، استخدم ملعقة لقطع سنتيمتر واحد بمقدار سنتيمتر واحد مربعات. ثم انقل المربعات المقطوعة إلى شريحة زجاجية لتجميع الأوراق في نفس المستوى ، ضع ميكرولتر واحد من محلول الورقة على قطعة من الألواح

بعد دقيقتين ، يجب أن تمتص الأروس المخزن المؤقت تاركا الأوراق على السطح. صور الورقة في غضون 15 دقيقة. بدلا من ذلك ، لتحميل أوراق الصور والمحلول 15 ميكرولترا داخل حشية قطرها 20 ملم 0.12 ملم على شريحة زجاجية.

قم بتغطية العينة بقلة غطاء وصورة في غضون أيام قليلة لإجراء SEM لأوراق النانو. أول رقائق سيليكون حفر البلازما للمساعدة في امتصاص صفائح النانو. ثم قم بإسقاط 20 ميكرولترا من محلول ورقة الببتيد على ركيزة سيليكون معالجة بالبلازما واترك المحلول يجلس بعد ثلاث دقائق ، وقم بإزالة المحلول الزائد بطرف ماصة Kim Wipe 20 ميكرولترا من الماء على السطح وقم مرة أخرى بإزالة المحلول الزائد لإزالة العازلة والأملاح.

بدلا من ذلك ، يتم غسيل محاليل الألواح الببتيدية بالماء لإزالة العازلة والملح. في هذه الحالة ، يمكن إسقاط 20 ميكرولترا من محلول الألواح المحالة للغسيل على ركائز السيليكون المعالجة بالبلازما والسماح لها بالجفاف في الهواء. بعد أن يجف محلول الصفيحة على ركائز السيليكون المعالجة بالبلازما ، يمكن تصوير الورقة باستخدام SEM باستخدام كاشف العدسة في طاقات الشعاع بين كيلو فولت واحد وخمسة كيلو فولت.

تم إجراء توصيف التوليف وتنقية ببتيد شحنة كتلة 36 me الخاص بالتسلسل الذي يتم طيه في صفيحة نانو ثنائية الأبعاد عالية الترتيب. الأمينات التي تستخدم تخليق الببتيد الشحنة كتلة 36 me سوف تتسبب في إحداث ثنائي الإيثيلين إلى فينيثيل وأمين و t بوتيل بيتا ألانين. بعد التوليف ، تم شق الببتيد الخام من الراتنج بنسبة 95٪ TFA مائي.

بعد جمع محلول TFA وتبخره. تم تنقية الببتيد الخام 36 me block charge باستخدام HPLC الطور العكسي. ثم تم تأكيد كتلة الببتيد المنقى بواسطة العفن.

تتطابق الكتلة المرصودة 4981.2 بشكل وثيق مع الكتلة المحسوبة البالغة 4981.74. تم إذابة المسحوق المجفف بالتجميد في DMSO لصنع محلول مخزون بملليمولار وتخزينه عند أربع درجات مئوية. تم إعداد الأوراق بواسطة البروتوكول والصورة المذكورة أعلاه باستخدام الفحص المجهري البصري الفلوري.

لوحظت مجموعة متنوعة من الأشكال ذات أحجام الميزات التي تصل إلى 300 ميكرون ، ولا سيما الحواف المستقيمة بارزة. تم استخدام SEM أيضا لتصوير الأوراق التي تكشف بالمثل عن حواف مستقيمة بارزة. يصف هذا الفيديو بروتوكولا مباشرا وفعالا لتخليق الوجه الصلب للببتيدات والتجميع الذاتي المائي للببتيدات في صفائح نانوية.

نظرا لأن المئات من اللبنات الأساسية تعني حرفيا متاحة بسهولة ويمكن استخدامها في هذا البروتوكول ، فإن مساحة التصميم التي يمكن الوصول إليها باستخدام عديد الببتيدات لا حدود لها عمليا. الببتيدات هي مواد واعدة لأبحاث الطب الحيوي وعلوم النانو بسبب مرونتها الاصطناعية وقوتها وترتيبها. على المستوى الذري على وجه الخصوص ، تعمل صفائح النانو كمنصة محتملة لسقالات العرض ثنائية الأبعاد ، وتقليد الأغشية ، وأجهزة الاستشعار البيولوجية ، وتقليدات البروتين ، وتصنيع الأجهزة.

يعد العمل مع الكواشف المسببة للتآكل مثل تريور وحمض الأسيتيك وحمض البرومو خطيرا للغاية لمنع الإصابة وإجراء جميع التفاعلات في غطاء الدخان وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.